细胞周期蛋白D细胞周期蛋白依赖性激酶4/6-E2F信号通路在正常细胞和肿瘤细胞的G1-S细胞周期转变中都起着重要作用。该途径的失调在包括乳腺癌细胞在内的癌细胞中很常见。特别是CCND1的转录或扩增失控在乳腺癌中经常观察到基因，细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物的组成性激活，涉及p16的遗传或表观遗传失活。此外，细胞周期蛋白D1是由雌激素受体途径诱导的靶基因之一，该途径在大多数乳腺癌中均被激活。基于这些发现，临床上已经引入了一种抑制细胞周期蛋白D-CDK4/6-E2F和ER通路的新治疗策略，以治疗ER阳性和人表皮生长因子受体2阴性乳腺癌。
　　 三种特定的CDK4/6抑制剂帕博西尼(Palbociclib)，ribociclib和abemaciclib已在临床上开发并引入，帕博西尼(Palbociclib)是主要化合物。多项临床试验表明，帕博西尼(Palbociclib)与内分泌疗法的联合治疗可延长ER/HER2晚期乳腺癌患者的无进展生存期。此外，这些联合疗法可延长某些乳腺癌患者的总体生存期。有数项正在进行的临床试验正在使用帕博西尼(Palbociclib)与不同的信号转导抑制剂或免疫检查点抑制剂。这些研究表明，帕博西尼(Palbociclib)不仅可以用于治疗ER/HER2乳腺癌，而且可以用于治疗其他亚型的乳腺癌。
　　 根据临床前研究，CDK4/6抑制剂具有至少四个不同的作用机制，这些机制负责其抗肿瘤活性。第一种机制是将细胞维持在G1-S封锁诱导的静止状态。第二个是细胞周期停滞后的细胞衰老，这使细胞无法进入细胞周期。第三种机制是改变细胞代谢并诱导细胞凋亡。第四是通过增强肿瘤细胞的抗原性和抑制阴性调节细胞来产生免疫调节作用。另外，已经提出CDK4/6抑制剂通过抑制CSC自我更新来降低癌症干细胞的比例。癌组织中CSC的减少可能会延长对CDK4/6抑制剂的抗肿瘤反应。
　　 了解负责CDK4/6抑制剂抗肿瘤活性的作用机制对于开发新的联合治疗策略来管理乳腺癌患者非常重要。因此关注印度仿制药的药神网进行了系统的研究，以研究帕博西尼(Palbociclib)在不同亚型的乳腺癌细胞中的作用机制。特别是，帕博西尼(Palbociclib)的抗CSC效应和分子机制仍有待阐明。因此，关注印度仿制药的药神网使用三种不同的CSC分析评估了其抗CSC活性。此外，关注印度仿制药的药神网使用各自的小干扰RNA进行了CDK4或CDK6表达的敲除，以阐明哪个CDK负责帕博西尼(Palbociclib)的抗CSC作用。
　　 在原发性和晚期病例中，ER/HER2乳腺癌是最常见的类型。长期以来，这种亚型的乳腺癌患者一直在辅助或转移的情况下接受内分泌治疗。然而，经常发展出对内分泌治疗的原发性和获得性抗药性，并且干扰了该亚型乳腺癌的控制。最近，与单独的内分泌治疗相比，mTOR抑制剂依维莫司被引入来改善该亚型乳腺癌绝经后患者的客观反应和PFS。此外，已引入CDK4/6抑制剂以改善绝经后和绝经前患有亚型转移性乳腺癌的患者的客观反应和PFS。
　　 转移性乳腺癌下长期暴露诱导通过mTOR途径的上调对内分泌治疗的内分泌抗性/HER2表明依维莫司功能。相反，CDK4/6抑制剂通过同时抑制该亚型乳腺癌中细胞周期蛋白D-CDK4/6-E2F和ER途径来增强内分泌治疗的抗肿瘤活性。应当指出，mTOR和CDK4/6抑制剂之间的抗肿瘤机制是不同的。
　　 临床前研究结果表明，CDK4/6抑制剂可阻断Rb的磷酸化，抑制G1-S细胞周期转变，并使细胞静止。这种细胞周期停滞被认为是CDK4/6抑制剂最重要的抗肿瘤作用机制。研究表明，CDK4/6抑制剂帕博西尼(Palbociclib)可以抑制Rb磷酸化并诱导不同亚型细胞系中的G1-S阻断。值得注意的是，如先前报道，帕博西尼(Palbociclib)未诱导凋亡。据报道，另一种CDK4/6抑制剂abemaciclib可诱导乳腺癌细胞凋亡。这两种CDK4/6抑制剂之间导致细胞凋亡的分子机制的差异尚待阐明。
　　 最近的临床前研究还发现，当用CDK4/6抑制剂治疗时，一些肿瘤细胞会静止，而另一些则会衰老。众所周知，衰老细胞不会返回细胞周期。CDK4/6抑制剂诱导衰老可能是重要的抗肿瘤机制。在本研究中，帕博西尼(Palbociclib)剂量依赖性地增加了所有检查过的乳腺癌细胞类型中β-半乳糖苷酶阳性衰老细胞的比例。尤其是，帕博西尼(Palbociclib)可逆转ER乳腺癌细胞中E2诱导的衰老细胞减少。这些发现表明，ER通路和细胞周期蛋白D-CDK4/6-E2F通路的伴随抑制作用协同诱导ER乳腺癌中的细胞衰老。
　　 关于帕博西尼(Palbociclib)对乳腺癌细胞的抗CSC作用的研究很少。报道称，使用siRNA阻断CDK4的CDK4表达或使用帕博西尼(Palbociclib)抑制激酶活性可防止干细胞自我更新以及ER/孕激素受体/HER2三阴性乳腺癌细胞的上皮-间质转化。过表达CDK4。他们还建议，CDK4对乳腺CSC自我更新的作用至少部分是通过下调骨形态发生蛋白4来实现的，骨形态发生蛋白4是一种被称为重要生长因子的转化生长因子β家族成员。CSC的致癌能力和分化因子。也有报道称帕博西尼(Palbociclib)特异地阻断了乳腺癌，肺癌和卵巢CSCs的繁殖，他们得出的结论是，帕博西尼(Palbociclib)可用于靶向多种癌症类型的端粒酶高增殖性CSCs。
　　 在本研究中，关注印度仿制药的药神网证实，帕博西尼(Palbociclib)剂量依赖性地减少的推定的CSCs的由三个不同的CSC测定中。值得注意的是，就生长抑制作用而言，由于对雌激素依赖性较低的KPL-1细胞似乎对帕博西尼(Palbociclib)的敏感性要高于对雌激素依赖性的MCF-7细胞，因此关注印度仿制药的药神网使用较低浓度的帕博西尼(Palbociclib)进行KSC-1细胞的CSC分析。就CSC抑制作用而言，KPL-1细胞似乎比MCF-7细胞更敏感。另一方面，在ER/HER2BT-474细胞中，就抗细胞生长活性而言，它们对帕博西尼(Palbociclib)有相对抗性，它没有显示出相似的抗CSC活性。帕博西尼(Palbociclib)对BT-474细胞的不良细胞生长作用以及HER2和ER信号转导之间的串扰可能会影响帕博西尼(Palbociclib)对BT-474细胞的CSC调节。众所周知，HER2信号的上调会增加与干细胞控制相关的基因的表达水平，并具有更高的自我更新潜能。另外，众所周知的是，HER2过表达或过度活化是内分泌抗性。这些发现支持HER2和ER信号传导之间的串扰可能影响CSC调节。但是，详细的动作机制还有待阐明。
　　 已建议CSC在肿瘤复发，转移和耐药中起重要作用，而这些癌细胞亚群已成为临床治疗策略的潜在细胞靶标。因此，帕博西尼(Palbociclib)的抗CSC作用可能会增强其抗肿瘤活性并延长ER/HER2乳腺癌患者的PFS。
　　 为了进一步探索帕博西尼(Palbociclib)的抗CSC机制，关注印度仿制药的药神网使用各自的siRNA敲低了CDK4或CDK6。先前报道CDK4抑制，但不是CDK6抑制，显着降低了CDK4过表达的三阴性乳腺癌细胞中假定的CSC的比例。在关注印度仿制药的药神网的研究中，CDK4抑制而非CDK6抑制导致ER/HER2乳腺癌细胞中由E2诱导的假定CSC的比例降低。因此，由帕博西尼(Palbociclib)诱导的CDK4抑制而非CDK6抑制可能是其在ER/HER2乳腺癌细胞中的抗CSC作用的原因。此外，由不同的CDK4/6抑制剂诱导的CDK4和CDK6活性之间的抑制作用差异可能会影响其对乳腺癌细胞的抗CSC作用。
　　 其他细胞系中类似siRNA实验的结果有些复杂。在CSC调节方面对帕博西尼(Palbociclib)没有反应的ER/HER2BT-474细胞中，单独的CDK4抑制作用以及联合的CDK4和CDK6抑制作用会增加假定的CSCs。在ER/HER2KPL-4细胞中，组合的CDK4和CDK6抑制作用降低了假定的CSC，但单独的CDK4或CDK6抑制作用却没有。在ER/HER2MDA-MB-231细胞中，单独的CDK4或CDK6抑制作用以及联合抑制作用都会降低假定的CSC。由于这项研究中测试的乳腺癌细胞系数量有限，因此难以理解导致这些复杂结果的作用机制。在不同亚型的乳腺癌细胞系中，CSC调节的作用机制可能不同。
　　 出乎意料的是，E2处理显着降低了ER/HER2MCF-7和KPL-1细胞中CDK6的表达。根据一些专家的论文，CDK6抑制而不是刺激了乳腺上皮细胞的增殖，并且它的丢失或下调可能在乳腺肿瘤的发展中起作用。雌二醇对CDK6表达的抑制作用可能会促进ER乳腺癌细胞中的细胞增殖。这些有趣的现象应进一步探索。
　　 有趣的是，敲除CDK4mRNA的表达会导致CDK6的mRNA表达水平更高，但是敲除CDK6不会影响大多数细胞系中CDK4的mRNA表达水平。CDK4和CDK6不仅是细胞周期启动所必需的，而且是负责细胞存活的调节因子。已经表明，CDK4对于细胞增殖是必不可少的，但CDK6在其中起补偿作用。这些发现至少可以部分解释这些现象，但造成这些现象的作用机制仍有待阐明。
　　 总之，关注印度仿制药的药神网的系统研究表明，帕博西尼(Palbociclib)不仅在ER乳腺癌细胞系中而且在ER细胞系中均显示出显着的抗肿瘤活性，这是通过对Rb磷酸化，G1-S细胞周期进程的抑制作用而介导的，细胞衰老和CSC的比例。此外，帕博西尼(Palbociclib)诱导的CDK4抑制可能是其抗CSC活性的原因。