酪氨酸激酶抑制剂在中的差异作用 |
Sorafenib和Regorafenib是晚期肝细胞癌患者的推荐的一线和二线治疗方法。与相应的推荐疗法相比，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib表现出非劣的抗肿瘤活性。临床试验已经确定了每种治疗的推荐剂量，这些剂量导致患者的索拉非尼，Regorafenib，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib具有不同的血药浓度。然而，归因于内在抗性或生存信号上调的患者观察到非常低的应答率。该研究的目的是对2D分化良好的，中度和低度分化的肝癌细胞中的药物进行剂量比较分析/3D文化。细胞具有野生型p53，无义p53突变，框内p53基因缺失和p53点突变。在3D和2D培养物中施用常规体外剂量以及在2D培养物中进行剂量反应分析表明，索拉非尼和Regorafenib在减少细胞增殖以及诱导分化良好的细胞凋亡和表达方面越来越有效HCC细胞中的野生型p53。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在中度至弱分化的p53突变或缺乏p53的细胞中特别有效，这些细胞的基础耗氧率，ATP和最大呼吸能力低于在分化的HCC细胞中观察到的水平。索拉非尼和Regorafenib被下调，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib会上调HepG2细胞的表皮生长因子受体和间充质-上皮转化因子受体。结论：索拉非尼和瑞戈非尼在分化良好的细胞中尤其活跃，具有野生型p53和线粒体呼吸增加。相比之下，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在中度分化至低分化的p53突变和线粒体呼吸低的细胞中似乎更有效。允许我们在肿瘤中增加剂量的策略的发展可能潜在地提高治疗的有效性。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在中度分化至低分化的p53突变和线粒体呼吸低的细胞中似乎更有效。允许我们在肿瘤中增加剂量的策略的开发可能会增强治疗的有效性。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在中度分化至低分化的p53突变和线粒体呼吸低的细胞中似乎更有效。允许我们在肿瘤中增加剂量的策略的开发可能会增强治疗的有效性。
肝癌是全世界第六大最常见的癌症，也是第四大最常见的癌症相关死亡原因。索拉非尼是护理的患者在晚期肝细胞癌阶段的标准。不同的III期临床试验显示，在第一线治疗方面，乐伐替尼（Lenvatinib）在总体中位生存率上在统计学上不逊于索拉非尼，对于无反应但耐受索拉非尼的患者，推荐将Regorafenib作为二线治疗。卡博替尼作为晚期HCC的二线治疗也显示出积极的结果。
索拉非尼是一个multityrosine激酶抑制剂和Raf-促分裂原活化蛋白激酶-extracellular信号调节激酶信号，在肝癌细胞有效的抗增殖和促凋亡性质。索拉非尼诱导的细胞死亡与PUMA和BIM的升高以及诱导的髓样白血病细胞分化蛋白和survivin的降低有关。索拉非尼引起持续的内质网应激，促进BimEL表达升高，该表达介导了HepG2从生存自噬途径向凋亡的转变。。Regorafenib，乐伐替尼（Lenvatinib）和卡博替也已显示出促进细胞死亡和抗增殖特性在体外和体内，使用不同的癌细胞系。
本研究的目的是确定肝癌细胞中细胞分化阶段和p53基因状态对酪氨酸激酶受体抑制剂有效性的影响。在2D和3D培养的肝癌细胞中对Sorafenib，Regorafenib，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib的抗增殖和促凋亡作用进行了剂量比较分析。该研究包括分化良好的，中度和分化程度低的HCC细胞系，以及表达野生型p53，无义p53突变的HCC细胞系。框内p53基因缺失，和p53点突变。
人原代肝细胞，细胞系和培养条件
从两名患者的肝活检样本中获得人类肝细胞，该肝活检样本在获得患者的书面同意后接受肝肿瘤手术切除。该研究方案已获得该机构伦理委员会的批准。人肝细胞的分离基于胶原酶的两步法，细胞的培养如前所述。Hep3B，Huh7，SNU423和SNU449细胞系在添加有Earle平衡盐的最低基本培养基中于37°C培养。含5％CO2的加湿培养箱。
根据液体覆盖技术产生了多细胞球体。在球体中分析了球体面积，非锥虫和锥虫蓝染色细胞，Ki67和TUNEL阳性细胞以及caspase-3活性。还以单层培养细胞。接种后24h给予治疗，并在不同时间点获得细胞裂解液，以测量细胞增殖和凋亡，如前所述。
细胞增殖
在3D和2D培养的细胞中评估细胞增殖。非台盼蓝染色的活细胞在胰蛋白酶处理的球状体，以及Ki67的阳性细胞进行定量如前所述在4％多聚甲醛固定切片球体通过免疫细胞化学测定。使用OlympusBX61显微镜进行免疫荧光分析。使用LeicaApplicationSuiteAdvancedFluorescence软件和ImageJ软件进行荧光定量。还使用商业测定法中包括的建议，通过将溴脱氧尿苷掺入2D培养细胞中来测量细胞增殖率。数据显示为在370nm处的相对吸光度，使用Infinite200PRO微孔读板仪作为参考波长492nm。
索拉非尼和Regorafenib的使用极大地减少了由HepG2，Hep3B和Huh7细胞产生的球状体面积。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib似乎对Huh7有效，但对HepG2和Hep3B细胞系无效。第10天，索拉非尼和Regorafenib减少Ki67阳性细胞，并提高caspase-3活性和TUNEL阳性细胞，同时减少非锥虫蓝染色活细胞，在第15天，球体中的台盼蓝染色的非存活细胞增加，比培养的球体中的乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib强。在2D培养的HepG2，Hep3B和Huh7细胞中，进一步评估了索拉非尼和Regorafenib与乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib相比在球体中的抗增殖和促凋亡作用增强。在2D培养的HepG2，Hep3B和Huh7细胞系中BrdU掺入和caspase-3活性部分证实了3D数据。在2D系统中培养的HepG2≥Hep3B≥Huh7中，索拉非尼和Regorafenib发挥着强效的抗增殖和促凋亡作用。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib也能够减少细胞增殖，并且在单层培养的HCC细胞中低水平地增加了HepG2细胞中的caspase-3活性。
Sorafenib，Regorafenib，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在原代人肝细胞和HCC细胞系中的分化和p53状态的剂量反应抗增殖和凋亡特性
索拉非尼在所有HCC细胞系中均在24h发挥有效的抗增殖活性。Regorafenib也发挥了抗增殖活性，但程度低于Sorafenib，其降序作用为HepG2≥Hep3B≥SNU423≥SNU449≥Huh7。但是，与未经处理的细胞相比，推荐剂量的Regorafenib诱导HepG2和Hep3B细胞增殖的中等程度降低。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在SNU423，SNU449和Hep3B细胞中似乎比HepG2和Huh7更有活性。特别是，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib减少了SNU423以及SNU423和SNU449细胞系中的细胞增殖。
索拉非尼在HepG2和Hep3B中诱导caspase-3活性。最高剂量的索拉非尼诱导HepG2，Hep3B，SNU423和Huh7细胞的下游caspase活性显着升高。Regorafenib也能发挥作用，但其程度低于Sorafenib，其凋亡能力呈递减顺序，即HepG2≥Hep3B≥SNU423≥Huh7≥SNU449。与未经处理的细胞相比，Regorafenib在HepG2和Hep3B中诱导caspase-3活性。尽管剂量反应研究表明，在所有细胞系中，最大剂量的乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib剂量均可增加caspase-3活性；然而，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在任何测试的细胞系中均不能诱导caspase-3。
肝癌细胞中线粒体呼吸的变化
我们评估了所有细胞系中基础条件下的OCR，线粒体依赖性ATP生成以及最大呼吸能力。与SNU423和SNU449细胞系相比，HepG2，Huh7和Hep3B显示出基础OCR和ATP生成增加。HepG2和Huh7而不是Hep3B具有比SNU423和SNU449更高的最大呼吸能力。
肝癌细胞中酪氨酸激酶受体的表达
定期使用体外剂量的Sorafenib和Regorafenib会降低EGFR和c-Met蛋白表达，而乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib会提高EGFR和c-Met蛋白表达。VEGFR，PDGR和FGFR的蛋白质表达未因处理而改变。
患者三分之二与HCC诊断出晚期接收处理为一阶或二线线疗法。但是，人们普遍观察到了耐药性，只有一小部分患者在治疗后有效延长了其生存期。
索拉非尼和Regorafenib在降低球体面积，细胞增殖和促进细胞死亡方面，比乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib发挥了更有效的相对有益特性。但是，详细分析显示3D和2D细胞培养模型中药物反应的差异。Sorafenib和Regorafenib减少的球体面积在所有以球体培养的细胞系中相似。然而，在单层培养的HepG2≥Hep3B≥Huh7细胞中，caspase-3活性的增加和BrdU掺入的降低程度较低，显示了药物的有效性显着下降顺序。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib减少了3D培养的Huh7中的球状体面积，但未减少HepG2和Hep3B中的球状体面积，似乎减少了BrdU的掺入，并且在较低程度上增加了caspase-3的活性，在所有2D培养的细胞系中。这些数据可能表明，尽管在3D和2D模型中药物反应中存在平行性，但可能可行的是，单层培养的细胞中未发生的球体低氧环境增加正在诱导细胞对抗增殖和促凋亡特性的抵抗力由治疗诱导。实际上，HIF-2alpha亚型的增强表达在球体中培养的HepG2细胞中产生了生存优势。
非台盼蓝染色的活细胞，台盼蓝染色的非活细胞，caspase-3活性和TUNEL阳性细胞增加。相比于第15天的对照HepG2细胞，第10天的Ki67阳性细胞减少。这些变化表明，在第10天，球体中存在活跃的细胞增殖，但在第15天时，它与细胞周期停滞和凋亡共存。球形体建立后第15天，在我们的实验条件下可能会出现释放的自分泌因子或身体约束。此外，Ki67阳性细胞的强烈减少，第10天由索拉非尼和Regorafenib诱导的caspase-3活性和TUNEL阳性细胞，以及台盼蓝染色非活细胞在第15天在HepG2。这种情况表明，在第10天观察到的Sorafenib和Regorafenib的早期细胞死亡激活和细胞增殖阻滞，对第15天球体中存活和死亡细胞的数量产生了影响。
p53是一种参与细胞周期控制，DNA修复，凋亡和细胞分化的抑癌基因，是肝癌中突变最多的基因之一，尽管突变的发生率因病因而异。p53和基因家族的其它p53相关组分的表达是在转录水平调控细胞死亡受体的表达与细胞凋亡。关联出现突变P53之间，和细胞分化程度和生存的肝癌患者。实验表明，与Lenvatininb和Cabozantinib相比，Sorafenib和Regorafenib在具有野生型53的HepG2中特别有效，而在2D培养的Hep3B和Huh7细胞系中观察到相对降低的抗增殖和凋亡特性。这种作用方式与我们先前的研究一致，后者显示索拉非尼在HepG2细胞中比Hep3b和Huh7细胞具有更强的促凋亡和抗增殖作用。索拉非尼也被示出为上调p53和促进p53依赖性凋亡。有人提出大多数HCC细胞中缺乏功能性p53作为索拉非尼耐药的可能机制。p53的过度表达使Hep3B对索拉非尼更加敏感，而从HepG2细胞中敲除p53则增加了其耐药性。
临床试验已确定索拉非尼，雷戈非尼，雷伐替尼和卡博替尼用于治疗晚期肝癌患者。剂量反应分析封闭了晚期HCC治疗患者血液中的浓度。索拉非尼和较低的Regorafenib在培养的HepG2细胞系中发挥最强的作用，而在2D培养的Huh7，SNU423和SNU449中响应则较低。尽管乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在推荐剂量下分别在SNU423，SNU423和SNU449中显示出中等的抗增殖作用。但是，我们的研究还表明，与推荐的剂量相比，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozanitib的活性更高。
细胞死亡的索拉非尼和Regorafenib感应已经涉及到在培养的肝细胞和大鼠肝线粒体级分线粒体功能障碍。我们已经观察到，SNU423和SNU449的基础OCR和线粒体依赖性ATP生成显着低于HepG2，Huh7和Hep3B。此外，HepG2和Huh7，但不是Hep3B细胞，比SNU423和SNU449具有更高的最大呼吸能力。Hep3B和SNU449的间质表型标记数量比PLC/PRF/5和Huh7的数量增加，它们与转化生长因子β和波形蛋白的表达增加，以及将6-磷酸葡萄糖分流至磷酸戊糖途径，总体上与E-钙粘蛋白表达和OCR降低平行。索拉非尼的促凋亡作用与线粒体功能障碍和HepG2细胞的糖酵解减少有关。在这项研究中，与推荐剂量相比，低剂量索拉非尼缺乏疗效与线粒体功能增强和糖酵解有关。根据一致结果表明，与Sorafenib在PLC/PRF/5中观察到的相比，SNU449中细胞活力下降的减少与抗线粒体呼吸下调有关。所有这些数据可能表明，与索拉非尼和Regorafenib不同，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib在线粒体呼吸减少，糖酵解和PPP途径增加表型增加，相关的细胞中具有相对较高的抗肿瘤活性。
HCC细胞的索拉非尼给药过程中的阻力已涉及到生存细胞的上调通过信令胰岛素生长因子受体介导，c-Met的，和FGFR。c-Met磷酸化和mTOR的激活还与患者来源的HCC异种移植物中对索拉非尼的耐药性有关。药神网的印度仿制药合作伙伴发现研究表明，索拉非尼降低Hep3B和Huh6细胞的活力。表达野生型p53的Huh6细胞系显示出比Hep3B细胞系增加的未分化细胞标志物和形态特征。Hep3B和Huh6对索拉非尼的耐药性与FGFR相关和EGFR或FGFR上调。Linsitinib，IGF1R/IR的双重TKI和pan-FGFR抑制剂BGJ398提高了索拉非尼在两种耐药细胞系中的有效性。，在具有乐伐替尼（Lenvatinib）和卡博替比较，与EGFR的下调和c-Met蛋白的表达培养HepG2细胞。
显示索拉非尼通过内在途径和肿瘤坏死因子-α依赖性外在途径使HCC细胞对TGF-β的凋亡活性敏感。索拉非尼的促凋亡活性与肝癌细胞中细胞死亡受体中S-亚硝基化的下调有关。根据我们的研究，未转化的肝细胞对索拉非尼诱导的细胞死亡无反应。Sorafenib，Regorafenib，乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib对原代人肝细胞的细胞增殖和死亡影响较小。
不同的报道表明，EMT和肝肿瘤细胞的化学抗性之间存在关联。与表达HepG2，Hep3B，PLC/PRF/5的上皮标记物相比，表达间充质标记物的SNU449，HLF和HLE肝癌细胞系对索拉非尼治疗无效。其他人也获得了类似的结论。使用来自患者的HCC细胞。实际上，使间质恢复为上皮表型的因素会增加HCC细胞对索拉非尼的反应性。对于肿瘤细胞对EGFR抑制剂的敏感性，EMT标志物的表达似乎比EGFR表达的上调或ERK信号的下游激活更相关。EMT状态还预测HCC细胞对HCC细胞中IGFR抑制剂的敏感性。肝癌的最新基因表达分类已鉴定出表达S-cadherin，c-myc和FGFR3-4蛋白表达的称为S2的存活率较差的亚类。有趣的是，S2基因签名包括Hep3B，HepG2和HuH7，但不包括SNU423，它们是高度易受FGFR1-4抑制剂抑制细胞增殖的细胞系。在我们的条件下，该乐伐替尼（Lenvatinib）目标FGFR3/4，显示出较低的抗增殖和促凋亡活性在HepG2，Hep3B细胞，和Huh7比SNU423细胞系。
总之，本研究表明，尽管在3D和2D模型中培养的分化良好的细胞中药物的有效性存在平行性，但可能是由于球体中产生的低氧环境会导致细胞中药物的次要作用与在2D培养的细胞中观察到的相比，在3D系统中培养的细胞更容易进行培养。在3D和2D培养物中施用常规体外剂量，以及在2D培养物中进行剂量反应分析表明，索拉非尼和Regorafenib越来越有效地减少细胞增殖，并诱导高分化和野生细胞凋亡型p53HCC细胞。乐伐替尼（Lenvatinib）和Cabozantinib比Sorafenib和Regorafenib在中度分化至缺乏突变或缺乏p53HCC细胞的细胞中更有效。 |
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