肝癌索拉非尼耐药的关键驱动因素 |
索拉非尼是晚期肝细胞癌的标准治疗方法。然而，耐药性的发展是普遍的。通过使用全基因组CRISPR/Cas9文库筛选，关注印度仿制药的药神网确定磷酸甘油酸脱氢酶是丝氨酸合成途径中的第一个定型酶，是索拉非尼耐药的关键驱动因素。索拉非尼治疗通过诱导PHGDH表达激活SSP。使用RNAi敲低和CRISPR/Cas9敲除模型，关注印度仿制药的药神网显示PHGDH的失活会使SSP麻痹，并减少αKG，丝氨酸和NADPH的产生。同时，索拉非尼治疗后，PHGDH的失活会升高ROS水平并诱导HCC凋亡。更惊人的是，PHGDH抑制剂NCT-503的治疗与索拉非尼具有协同作用，以消除体内HCC的生长。在其他FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂中也获得了类似的发现，包括瑞格菲尼（Regorafenib）或乐伐替尼（Lenvatinib）。总之，关注印度仿制药的药神网的结果表明，靶向PHGDH是克服HCC中TKI耐药性的有效方法。
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，全世界和每年导致超过700,000人死亡。肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型。HCC在病因上与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染，肝硬化，酒精中毒和非酒精性脂肪肝疾病相关。手术切除是肝癌患者的主要治疗方法。然而，由于侵袭性生长和晚期症状表现，大多数HCC患者被诊断为晚期，不符合手术治疗的条件。晚期肝癌患者的中位生存期约为9个月，而5年总生存率仅为10％。自2008年以来，索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，是FDA批准的唯一用于晚期HCC的一线药物，可显着改善无法切除的HCC患者的总体生存率。最近，瑞格菲尼（Regorafenib），索拉非尼，和Nivolumab，免疫检查点抑制剂的衍生物，已被FDA批准作为用于索拉非尼抗性HCC第二线治疗。最近，另一种TKI乐伐替尼（Lenvatinib）在一项随机III期临床试验中显示出与索拉非尼相当的生存获益6并已于2018年8月被FDA批准为HCC的新一线治疗药物。尽管取得了令人鼓舞的进展，但晚期HCC患者的治疗选择仍然非常有限，因此有必要进一步开发新的治疗方案。
索拉非尼靶向多种酪氨酸激酶，包括RAF，VEGFR和PDGFR，以抑制其下游增殖和生存信号通路。但是，索拉非尼治疗HCC的临床疗效不高，只能将患者的中位总生存期延长3个月。耐药性的发展被认为是导致HCC患者索拉非尼治疗失败的主要障碍。先前的研究表明，索拉非尼治疗部分通过抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤生长。然而，与索拉非尼治疗相关的肿瘤缺氧可导致癌细胞中HIF-1α或HIF-2α的活化，进而诱导VEGF的表达。和其它促血管生成因子以赋予HCC耐索拉非尼治疗。索拉非尼介导的抗增殖作用的主要机制是通过下调RAF/MEK/ERK途径。然而，肿瘤细胞可激活替代的信号传导途径，如EGFR，AKT，和mTOR，索拉非尼下治疗以维持细胞增殖。HCC细胞还可以引起自噬以减轻由索拉非尼治疗触发的内质网应激诱导的细胞死亡。最近的研究还报道了索拉非尼治疗可以上调干细胞标志物CD44和CD47的表达，并丰富肿瘤中肝癌干细胞的数量。肝癌干细胞是难治索拉非尼，并且因此可以在HCC患者延长索拉非尼治疗后占肿瘤缓解。然而，由于可耐受的安全性和可控的副作用，索拉非尼在临床上是一种有吸引力的分子靶向药物。为了克服索拉非尼耐药性，与其他抗癌药物，尤其是靶向与索拉非尼耐药性有关的分子的药物联合开发，越来越有利。例如，EGFR抑制剂吉非替尼或抗CD47抗体的共同治疗能有效提高索拉非尼在小鼠模型中的抗癌作用。索拉非尼耐药的潜在机制很复杂，并且仍然难以捉摸。对索拉非尼耐药性的分子基础进行进一步研究，可能会为确定合理的联合疗法克服索拉非尼耐药性的新靶标提供参考。
高通量正向遗传筛选方法已广泛应用于研究与特定细胞表型相关的分子机制，包括人类癌症的耐药性。使用shRNA文库下调特定靶基因的RNAi筛选是功能丧失筛选的公认方法。先前在携带HCC的小鼠中汇总的shRNA文库筛选已确定MAPK14是参与索拉非尼耐药的关键因素。但是，基于RNAi的筛选有一些局限性。RNAi仅敲低靶标mRNA的表达，而不能完全消除靶标基因。无效的基因敲低导致残留的mRNA表达，这可能会掩盖对功能丧失表型的观察，从而导致假阴性结果。另一个主要挑战是普遍的脱靶效应，可能会无意中干扰其他脱靶基因的表达，从而导致假阳性结果。基因组编辑技术特别是CRISPR/Cas9系统的最新创新极大地加速了哺乳动物细胞中功能基因组学的研究。CRISPR/Cas9系统首先在细菌和古细菌中发现，作为一种适应性免疫机制，可防止病毒DNA入侵。在哺乳动物细胞中，CRISPR/Cas9系统已经过工程改造，可为特定基因敲除引入移码突变。由于容易编程和高基因编辑功效，CRISPR/Cas9系统已越来越多地用于研究各种生物系统中基因功能的丧失。最近，不同的CRISPR/Cas9库已被开发用于哺乳动物细胞培养和小鼠模型基因筛查。所述CRISPR/Cas9文库筛选已经用于鉴定对于癌症细胞存活，增殖，迁移和电阻很重要的药物治疗在各种模型中的基因。与以前的基于RNAi的功能丧失筛选相比，CRISPR/Cas9敲除文库提供了更高的筛选敏感性，因为RNAi的不完全敲除有时可能不足以产生功能丧失表型。此外，CRISPR/Cas9文库筛选还以更低的噪音，最小的脱靶效应和更高的数据再现性优于RNAi筛选。
在这项研究中，关注印度仿制药的药神网用索拉非尼和媒介物对照治疗在HCC细胞中进行全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选，以系统评估索拉非尼耐药性的驱动机制。关注印度仿制药的药神网确定磷酸甘油酸脱氢酶，丝氨酸合成途径中的关键酶，是肝癌中索拉非尼耐药的关键驱动因素。索拉非尼治疗可升高细胞ROS水平并诱导细胞凋亡。HCC细胞激活PHGDH和丝氨酸合成途径，以产生抗氧化剂和α-酮戊二酸，以在索拉非尼诱导的氧化应激中存活。PHGDH的失活使HCC对索拉非尼诱导的细胞凋亡敏感。PHGDH抑制剂NCT-503的治疗与索拉非尼具有协同作用，以抑制小鼠模型中HCC细胞的生长。有趣的是PHGDH还涉及对瑞格菲尼（Regorafenib）和乐伐替尼（Lenvatinib）的耐药性。关注印度仿制药的药神网的发现表明，靶向PHGDH是克服人类肝癌中TKI耐药性的一种有前途的策略。
在这项研究中，关注印度仿制药的药神网进行了全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选，以鉴定与人类HCC的索拉非尼耐药有关的关键基因。抗索拉非尼的GI50相对较高的HCC细胞系MHCC97L被用作过表达Cas9蛋白的体外模型。人的GeCKOv2CRISPR文库A包含65,386个独特的sgRNA，其靶向19,052个蛋白质编码基因，并且使用1864个microRNA生成突变细胞池。然后，关注印度仿制药的药神网用媒介物或索拉非尼处理突变细胞池7天，以进行阳性和阴性筛选。关注印度仿制药的药神网假设敲除索拉非尼抗性驱动基因将使HCC细胞对索拉非尼诱导的细胞死亡或增殖抑制敏感。在存在索拉非尼的情况下，携带靶向索拉非尼抗性基因的sgRNA的细胞将在突变细胞池中被阴性选择，并且它们相应的sgRNA也将在文库中被耗尽，这可以通过高通量测序来确定。关注印度仿制药的药神网发现，与载体治疗组相比，索拉非尼7μM的治疗有效抑制了细胞增殖，这表明有效的选择压力。选择后，关注印度仿制药的药神网实现了约400倍的文库覆盖率，并且在所有样品中保留了约94％的sgRNA序列，从而确保了足够的读取死亡和文库覆盖率以用于CRISPR文库筛选。从该CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选中，关注印度仿制药的药神网确定了与媒介物对照相比，在索拉非尼（Sorafenib）处理的细胞中靶向984个基因的sgRNA子集显着耗尽，表明这些基因可能是索拉非尼（Sorafenib）耐药的潜在驱动因素。途径分析表明，这些基因参与细胞生长和粘附，蛋白酪氨酸激酶活性以及MAPK级联的调节，这与先前的汇集的shRNA文库筛选结果相呼应15。在基因列表中，磷酸甘油酸脱氢酶是SSP的限速酶，被确定为索拉非尼治疗后选择最阴性的基因。所有PHGDH靶向sgRNAs在索拉非尼处理的细胞显着降低，这意味着PHGDH的丧失可能敏感HCC细胞对索拉非尼治疗。此外，关注印度仿制药的药神网测试了其他基因对通过CRISPR/Cas9敲除文库筛选确定的基因列表顶部的影响。关注印度仿制药的药神网发现敲除AKT1S1，TBL1Y，SKAP2和AMPD2仅在存在索拉非尼时才显着诱导HCC细胞凋亡，这表明这些基因也与索拉非尼耐药有关，而CRISPR/Cas9敲除文库筛选的结果可以概括。在进行CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选的同时，关注印度仿制药的药神网还进行了RNA-seq监测在索拉非尼（Sorafenib）处理下MHCC97L细胞的转录组变化长达4个月。索拉非尼治疗后细胞活力的提高和凋亡的减少证明了索拉非尼耐药细胞的成功发育。途径分析表明在索拉非尼耐药细胞中发现了SSP的激活。尤其是，关键的SSP酶，PHGDH，磷酸丝氨酸氨基转移酶和磷酸丝氨酸磷酸酶的表达均通过索拉非尼治疗得到诱导。使用qRT-PCR进一步验证了诱导。以上结果表明，PHGDH和SSP可能在索拉非尼耐药的发生中起重要作用。
为了验证关注印度仿制药的药神网的CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选的结果，关注印度仿制药的药神网通过用文库中包含的三个sgRNA和另外两个独立的sgRNA感染MHCC97L-Cas9细胞来生成PHGDH稳定的基因敲除亚克隆。Western印迹证实，所有sgRNA序列均能有效敲除MHCC97L细胞中的PHGDH。PHGDHKO亚克隆在体外显示出对HCC细胞增殖的轻度抑制作用，而PHGDH的KO有效抑制细胞增殖并显着诱导凋亡。在索拉非尼的存在下。为了通过正交方法巩固关注印度仿制药的药神网的CRISPR/Cas9敲除文库筛选结果，关注印度仿制药的药神网使用了两个独立的shRNA序列在MHCC97L中生成了PHGDH敲除亚克隆。一致地，shRNA介导的PHGDH的敲低概括了sgRNA介导的KO细胞对索拉非尼（Sorafenib）治疗的敏化作用。在索拉非尼存在的情况下，PHGDH的抑制还可以显着诱导细胞凋亡。接下来，关注印度仿制药的药神网试图使用体内模型来确认这一观察结果。关注印度仿制药的药神网分别在裸鼠的左侧和右侧分别接种了PHGDH敲除和非靶标对照MHCC97L。当肿瘤在第21天变得明显时，将小鼠用索拉非尼或溶媒对照治疗另外21天。更为显着的是，尽管从NTC细胞产生的肿瘤稳定增长，但索拉非尼治疗完全阻碍了小鼠PHGDH细胞的肿瘤生长。上述发现表明，PHGDH的失活使HCC细胞对索拉非尼治疗敏感。
为了证实PHGDH对索拉非尼耐药性的影响，关注印度仿制药的药神网通过LC-MS分析对具有最佳击倒效率的击倒克隆进行了代谢组学研究。抑制PHGDH会引起3PG的积累，并显着降低NADH与NAD的比例，αKG与谷氨酸和丝氨酸的比例，表明进入SSP的代谢产物减少。糖酵解代谢产物通过PHGDH传导至SSP。敲除PHGDH会同时引起大多数糖酵解代谢产物G1P，G6P，F6P，F1,6P，G3P，PEP和丙酮酸的积累，表明糖酵解代谢产物在敲除PHGDH时不能分支成SSP。有趣的是，乳酸水平没有改变，表明总的葡萄糖摄取率可能没有改变。为了直接评估索拉非尼对丝氨酸合成的影响，关注印度仿制药的药神网分别将带有葡萄糖和索拉非尼和媒介物的MHCC97L细胞培养48小时，以通过质谱研究C13标记的丝氨酸水平。索拉非尼显着增加HCC细胞中的丝氨酸。丝氨酸与叶酸循环有关，产生重要的抗氧化剂NAPDH。由于NADPH是相对不稳定的代谢产物，因此关注印度仿制药的药神网使用NADPH检测试剂盒独立地定量了NADPH的水平。敲低的PHGDH深刻减少NADPH的产生。由于NADPH是维持硫氧还蛋白和谷胱甘肽还原能力的关键抗氧化剂，关注印度仿制药的药神网接下来研究了一般活性氧染料和线粒体ROS染料MitoSOXTM的氧化应激水平。降低PHGDH或索拉非尼治疗可独立升高ROS水平。在索拉非尼的存在下，PHGDH的敲低会急剧诱导ROS。有趣的是，扫描电子显微镜显示线粒体的ista在单药治疗后不那么完整，并且在联合治疗后会进一步恶化。此外，关注印度仿制药的药神网证明了PHGDH在H2O2或tBHP处理诱导的氧化应激时，其表达显着升高。关注印度仿制药的药神网进一步证明，PHGDH的诱导依赖于氧化应激反应的主要转录调节子NRF2，因为索拉非尼（Sorafenib）治疗可显着诱导NRF2，而敲除NRF2则可显着降低PHGDH的mRNA和蛋白表达。索拉非尼的存在。先前在非小肺癌中的研究表明NRF2通过ATF4调节PHGDH表达。为了确认ATF4是否参与肝癌的PHGDH调控，关注印度仿制药的药神网建立了ATF4敲低MHCC97L细胞系，并验证了ATF4在细胞中的成功敲低。有趣的是，关注印度仿制药的药神网发现索拉非尼治疗也可以诱导ATF4，并且索拉非尼处理后PHGDH的表达在ATF4稳定的基因敲除细胞的mRNA和蛋白质水平均显着降低。结果表明，ATF4也参与调节HCC细胞中PHGDH的表达。更有趣的是，细胞渗透性αKG或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以部分挽救索拉非尼和PHGDH抑制剂联合治疗所产生的作用，这表明PHGDH抑制剂通过消耗αKG和增加ROS的产生使HCC细胞对索拉非尼敏感。该观察结果与由PHGDH敲低引起的代谢变化相呼应。上述发现还表明，HCC细胞可以通过增加PHGDH的表达来应对索拉非尼治疗引起的氧化应激。PHGDH的失活降低了REDOX的能力，因此使细胞更容易受到索拉非尼的影响。
NCT-503是对PHGDH抑制具有特异性的小分子抑制剂。关注印度仿制药的药神网确定了MHCC97L细胞系中NCT-503的GI50，发现NCT-503的处理显着降低了细胞中NADPH/NADP+的相对比例。为了测试PHGDH抑制剂是否可以与索拉非尼协同抑制HCC生长，关注印度仿制药的药神网分别用4μM索拉非尼，单独40μMNCT-503、4μM索拉非尼和40μMNCT-503共同处理MHCC97L细胞48小时。AnnexinV和PI染色证明单独的索拉非尼可以诱导细胞凋亡。令人惊讶的是，尽管NCT-503本身仅能轻微诱导凋亡，但NCT-503可使索拉非尼诱导的凋亡细胞数量增加一倍。为了测试NCT-503与索拉非尼的协同作用是否是由于PHGDH抑制而引起的，关注印度仿制药的药神网还测试了其他PHGDH抑制剂NCT-502和CBR-5884。一致地，两者都可以显着提高索拉非尼诱导的凋亡细胞数量。在关注印度仿制药的药神网较早建立的耐索拉非尼的MHCC97L细胞中，关注印度仿制药的药神网发现，与接受索拉非尼单次治疗的亲代HCC细胞相比，凋亡明显减少。然而，通过NCT-503抑制丝氨酸可成功诱导耐索拉非尼的MHCC97L细胞与索拉非尼一起凋亡，进一步表明NCT-503有效克服了索拉非尼的耐药性。接下来，关注印度仿制药的药神网在裸鼠中进行了MHCC97L细胞的皮下注射。当可触知肿瘤时，将小鼠随机分为四组，分别用索拉非尼，单独的NCT-503，索拉非尼和NCT-503以及媒介物对照治疗。索拉非尼和NCT-503分别口服和腹膜内给药。单独使用索拉非尼和NCT-503可以降低体内HCC的生长，同时联合治疗索拉非尼和NCT-503可以完全阻止体内HCC的生长。值得注意的是，在三个用药物治疗的组中，小鼠的体重保持不变。而且，在药物治疗过程中，小鼠没有可观察到的异常行为。这些数据一起证实PHGDH抑制剂可以使HCC对索拉非尼治疗敏感。
为了确认关注印度仿制药的药神网的研究不限于索拉非尼，关注印度仿制药的药神网用另外两种TKIs 瑞格菲尼（Regorafenib）和乐伐替尼（Lenvatinib）治疗了MHCC97L。关注印度仿制药的药神网的研究结果表明，瑞格菲尼（Regorafenib）和乐伐替尼（Lenvatinib）都可以在治疗后3天早期诱导PHGDH，PSAT1和PSPH表达。与索拉非尼相似，瑞格菲尼（Regorafenib）和乐伐替尼（Lenvatinib）可以轻微诱导细胞凋亡。令人惊讶的是，NCT-503与瑞格菲尼（Regorafenib）或乐伐替尼（Lenvatinib）一起可显着增加HCC细胞的凋亡。这些发现表明，PHGDH，PSAT1和PSPH的上调可导致SSP升高这是导致HCC患者TKI耐药的常见机制，因此靶向PHGDH可能是改善HCC患者TKI治疗疗效的有前途的联合治疗策略。为了研究在不同类型的癌症中SSP的诱导是否可能是其他索拉非尼样小分子的标志，关注印度仿制药的药神网检查了可在连通性图上获得的2514个小分子的转录表达谱并将其排名通过它们诱导SSP的能力。令关注印度仿制药的药神网惊讶的是，关注印度仿制药的药神网发现小分子与索拉非尼（Sorafenib）在相同的药理学类别中显着富集了高度诱导SSP的化合物。这些药理学类别也位于在CMap的所有171个类别中诱导SPP的列表的顶部。大多数索拉非尼样小分子可在多种类型的癌细胞中显着诱导PHGDH，PSAT1和PSPH的表达。提示SSP的诱导是对索拉非尼样小分子治疗的响应，并且针对PHGDH的靶向治疗可能在更广泛的联合治疗中应用于更多类型的癌症。
通过无偏倚的全基因组CRISPR/Cas9KO文库筛选和转录组测序，关注印度仿制药的药神网确定SSP是导致HCC中TKI耐药的最重要途径，并且关注印度仿制药的药神网证明了靶向SSP致敏HCC细胞第一个酶的PHGDH抑制剂可用于TKI治疗。
CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选使研究人员能够在全基因组范围内鉴定促成特定表型的基因。在这项研究中，关注印度仿制药的药神网通过使用Gecko的V2A库如以前被别人所描述的库筛选策略。通过访问阅读深度，每组中缺失的sgRNA的数量，sgRNA的覆盖范围，对关注印度仿制药的药神网的文库筛选进行质量检查。此外，关注印度仿制药的药神网发现，先前报道的1580个必需基因在载体对照组的第7天进行显著耗尽相比于第0天，从而证实了筛选。
在功能上，关注印度仿制药的药神网通过文库中的三个sgRNA和两个其他sgRNA验证了PHGDH在索拉非尼耐药中的作用。除了PHGDH之外，关注印度仿制药的药神网还通过筛选索拉非尼耐药性证实了最重要的基因的作用。关注印度仿制药的药神网的敲除文库筛选结果也与先前在小鼠HCC模型中进行的汇总shRNA敲除文库相呼应，后者确定MAPK途径是HCC中索拉非尼耐药的重要机制。
过去，大多数关于丝氨酸和SSP的研究都取决于它们在神经生物学中的功能。丝氨酸是众所周知的是一种神经递质和PHGDHKO小鼠表现出神经系统疾病，不能生育后长期生存。来自糖酵解的SSP分支由三个固定步骤组成，这些步骤由三种酶PHGDH，PSAT1和PSPH进行。PHGDH执行NAD+3PG依赖氧化为3PHP。PSAT1使用谷氨酸作为产生αKG的氨基供体，进行将3PHP转化为3PS的氨基转移反应。PSPH最终将3PS磷酸化为丝氨酸。丝氨酸是与叶酸循环密切相关的代谢产物，可产生抗氧化剂。SHMT将丝氨酸转化为甘氨酸，向四氢叶酸骨架提供1个碳原子以启动叶酸循环。叶酸循环中的酶包括MTHFD1，MTHFD2/L和ALDH1L1/2直接产生主要的抗氧化剂NADPH。叶酸循环还产生5,10-meTHF，用于通过TYMS生产胸苷和通过MTHFR和MTR生产蛋氨酸。叶酸循环还会产生10-甲酰基THF，该GART/ATIC可以将其用于嘌呤生产。总之，SSP与叶酸循环共同产生了几种关键代谢产物，包括NADH，αKG，丝氨酸，NADPH，胸苷酸，蛋氨酸，嘌呤和丝氨酸。丝氨酸对于磷脂酰丝氨酸和鞘氨醇的生产很重要。丝氨酸还用作甘氨酸和半胱氨酸的前体，这是谷胱甘肽的两个核心成分。由于关注印度仿制药的药神网的培养基中存在过多的丝氨酸，鉴于表达了HCC细胞中的丝氨酸转运蛋白，丝氨酸本身不足以赋予HCC细胞TKI抗性。关注印度仿制药的药神网的数据表明，由于SSP产生额外的代谢产物，外源丝氨酸不能替代SSP产生的丝氨酸。
独立组已经证明，在乳腺癌细胞模型PHGDH的不同亲致瘤性的影响。敲低PHGDH和PSAT1降低了细胞αKG的显着比例，这支持了TCA循环的过早反应。同时证明了NCT-503对PHGDH的抑制抑制了胸苷和AMP的产生。在这里，关注印度仿制药的药神网表明αKG和NAC可以挽救索拉非尼治疗的HCC细胞的凋亡，这表明PHGDH抑制的敏化作用与αKG的消耗和ROS的增加有关。αKG补充了TCA周期的抗动脉粥样硬化反应。通过脱甲基酶和脯氨酰羟化酶进行酶促反应需要αKG。αKG的降低可能导致DNA和组蛋白的甲基化过高，从而导致表观遗传格局发生变化。αKG的减少可能会导致HIF的激活，而PIF会抵消这种激活。同位素示踪实验表明，PHGDH至少贡献了细胞中αKG池的50％。惊人地发现PHGDH在染色体1p处的基因组扩增是其在黑素瘤和乳腺癌中过表达的原因。转录因子的激活也可能导致PHGDH的过度表达。此外，PHGDH，PSAT1，PSPH和SHMT已显示为ATF4的直接转录靶标，在非小细胞肺癌模型中被NRF2激活。上调PHGDH与乳腺癌患者的预后不良有关。PHGDH，PSAT1，PSPH的转录c-MYC可以在营养饥饿的情况下被激活，例如葡萄糖，谷氨酰胺或无丝氨酸/甘氨酸的条件。c-MYC驱动的SSP通过核苷酸和GSH合成促进了HCC的存活，使细胞能够抵抗ROS，逃避细胞凋亡并经历细胞周期进程。与另一份报告一致，关注印度仿制药的药神网发现PSPH是唯一在人类HCC中过表达的SSP基因，而有争议的在人类HCC中过表达PHGDH和PSAT137。然而，TKIs可以清楚地诱导所有SSP基因，这表明SSP为TCC诱导的应激中的HCC细胞存活提供了独特的优势。由于在TKI处理后不久就诱导了SSP基因，关注印度仿制药的药神网推测这种反应是转录因子介导的适应性反应，而不是遗传改变。
NCT-503被确定为NIH分子图书馆小分子知识库药物库中的特定PHGDH抑制剂，其中包含40,000种化合物。使用其中涉及加上心肌黄酶，其将刃天青为试卤灵作为读出，识别的另一PHGDH抑制剂，CBR-5884另一组PHGDH活性测定相同筛选方法，从含有化合物800000的小分子药物库。尽管CBR-5884在体内的溶解度很低，但CBR-5884在体外对乳腺和黑色素瘤细胞的SSP以及生长抑制均表现出极大的影响。NCT-503和CBR-5884在表现出高水平PHGDH的癌细胞中均表现出更高的生长抑制作用，尤其是在细胞外丝氨酸耗尽的情况下。涉及修饰PHGDH抑制剂以提高其生物利用度的未来研究将普及使用PHGDH抑制剂作为癌症治疗方法。
关注印度仿制药的药神网的研究是首次采用无偏倚的全基因组CRISPR-文库筛选系统性地鉴定PHGDH和SSP是与TKI耐药相关的最重要的基因和途径。这对于肝癌治疗尤其重要，因为TKI是HCC患者的唯一一线治疗选择。分散的研究简要报告了PHGDH在耐药性中的重要性。使用代谢组学和蛋白质组学方法发现，PHGDH与骨髓瘤细胞中硼替佐米的耐药性有关。使用转录组测序方法，还发现PGHDH与肾癌中的舒尼替尼耐药有关。尽管这些药物的作用机制各不相同，但这些数据与关注印度仿制药的药神网的数据一起证实了在药物治疗下，代谢重建在适应生存中的重要性。SSP代表药物治疗下癌细胞的代谢脆弱性，而通过PHGDH抑制剂靶向SSP是TKI耐药HCC的一种有吸引力的治疗方法。 |
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