肿瘤血管中活化的抗性至关重要 |
抗血管内皮生长因子治疗对多种类型的实体癌具有抗肿瘤活性。已经阐明了几种抗VEGF疗法的抗药性机制。然而，人们对产生抗性的机理了解甚少。在这里，经营印度仿制药的药神网开发了由小鼠VEGFR2细胞外域与人IgG4片段可结晶区域融合而成的慢性表达所驱动的新型抗VEGF治疗耐药性模型。在表达VEGFR2-Fc的耐药性肿瘤中，经营印度仿制药的药神网证明了FGFR2信号通路被激活，而表达高水平FGF2的周细胞与内皮细胞共定位。乐伐替尼（lenvatinib）是一种多重酪氨酸激酶抑制剂，包括VEGFR和FGFR抑制作用，在对VEGFR2-Fc表达的耐药性肿瘤中显示出显着的抗肿瘤活性，伴随着肿瘤血管面积的减少和肿瘤中磷酸化FGFR2的抑制。经营印度仿制药的药神网的发现揭示了在抗VEGF疗法耐药的肿瘤中，周细胞与内皮细胞之间的细胞间FGF2信号传导在维持肿瘤脉管系统中起着关键作用。
抗血管内皮生长因子治疗，抗VEGFR2Ab和靶向VEGFR2的多种酪氨酸激酶抑制剂已被用于治疗多种类型的实体癌，十年。尽管巨大的努力，取得的耐抗VEGF治疗的机制尚不完全清楚。
其他血管生成因子如成纤维细胞生长因子，血管生成素，和血小板衍生生长因子已经报道以诱导肿瘤血管生成作为单一因子或与VEGF串扰。通过DC101治疗的RIP1-Tag2小鼠和人头颈部鳞状细胞癌异种移植肿瘤模型中均报道了通过慢性抗VEGF治疗上调FGF的表达。贝伐单抗治疗。在MCaIV同基因肿瘤模型的研究中，癌症相关的成纤维细胞和脂肪细胞表达FGF2并介导了对抗小鼠VEGFAbB20的抗性。另外，在Y-MESO-14异种移植肿瘤模型中，类纤维细胞通过产生FGF2介导了对贝伐单抗的耐药性。相反，嵌合双诱饵受体同时抑制VEGFR和FGFR增强了A549和Caki-1异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。这些结果表明，FGF信号传导途径有助于抗VEGF治疗。然而，很大程度上未知的是，当肿瘤获得抗VEGF疗法的抗性时，FGF信号通路如何被激活。最近，癌症的免疫力的VEGF信号通路中的作用受到了更多，因为抗VEGF治疗的免疫检查点抑制剂在临床前模型的承诺相结合的抗肿瘤活性的关注和临床试验。因此，了解获得性抗VEGF治疗耐药性的机制变得越来越重要。
在这里，经营印度仿制药的药神网通过在Renca小鼠肾细胞癌和B16F10小鼠黑素瘤中表达小鼠VEGFR2细胞外域与人IgG4片段可结晶区的融合蛋白，开发了获得新的抗VEGF治疗抗性的肿瘤模型细胞系。使用这些获得性抗性模型，经营印度仿制药的药神网分别通过免疫组织化学分析和差异表达基因分析评估了肿瘤血管生成和激活的细胞信号通路。从结果中，经营印度仿制药的药神网确定了肿瘤血管中FGF信号通路的激活在抗VEGF治疗的抗性中起主要作用。此外，在这些模型中，对FGFR和VEGFR的双重抑制克服了对抗VEGF治疗的耐药性，增强了抗肿瘤活性以及抗血管生成活性。
为了建立抗VEGF的耐药模型，经营印度仿制药的药神网将Mock载体或VEGFR2-Fc融合基因的表达载体引入到Renca和B16F10细胞中。从建立的肿瘤细胞的细胞培养物中收集上清液，以评估VEGFR2-Fc与VEGF的特异性结合。VEGFR2-Fc与VEGF相互作用，但不与FGF1或FGF2相互作用。为了检查VEGFR2-Fc的生物学功能，经营印度仿制药的药神网通过与表达Mock或表达VEGFR2-Fc的肿瘤细胞共培养，与人脐静脉内皮细胞进行了VEGF诱导的夹心管形成试验。将肿瘤细胞铺在两层胶原蛋白凝胶的上面，在这两层胶原蛋白凝胶之间嵌入HUVEC。在Renca和B16F10模型中，与表达VEGFR2-Fc的肿瘤细胞共培养可显着消除VEGF诱导的管形成。
为了评估体内肿瘤的生长，经营印度仿制药的药神网将表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤细胞皮下接种到同系小鼠中。与RencaMock和B16F10Mock肿瘤相比，RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc体内肿瘤的生长显着延迟。相比之下，模拟和表达VEGFR2-Fc的肿瘤细胞的体外2D细胞生长曲线几乎彼此相同。接下来，经营印度仿制药的药神网评估了RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc中的肿瘤血管生成通过用抗CD31Ab染色内皮细胞来发现肿瘤。与Mock肿瘤相比，表达VEGFR2-Fc的肿瘤显示出抑制的血管新生，肿瘤血管的面积减少了。但是，仍然发生了一些血管生成。通过对约500mm3切除的肿瘤的肿瘤裂解液进行蛋白质印迹分析，经营印度仿制药的药神网证实在RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc肿瘤中，VEGFR2-Fc的表达得以维持。在免疫沉淀分析中，肿瘤中的VEGFR2-Fc与内源性VEGF特异性相互作用，而与FGF1或FGF2不特异性相互作用。为了排除可溶性Fc蛋白影响肿瘤生长或血管生成的可能性，建立了稳定表达可溶性Fc的转染子。在Renca和B16F10模型中，模拟表达和可溶性Fc表达的肿瘤细胞在体内的肿瘤生长和肿瘤血管生成相似，这表明IgG4Fc蛋白不具有抗肿瘤或抑制作用。抗血管生成活性。这些结果表明，RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc肿瘤在体内持续生长通过逃避VEGF信号传导途径的逃避，即使由于VEGFR2-Fc抑制肿瘤血管生成而延迟了肿瘤生长。因此，经营印度仿制药的药神网将表达VEGFR2-Fc的Renca和B16F10肿瘤定义为抗VEGF耐药模型。
到长期暴露于VEGFR2-Fc的后识别在肿瘤中活化的细胞信号传导途径，是通过使用模拟和VEGFR2-Fc的进行RNA测序分析-表达肿瘤。经营印度仿制药的药神网在Renca模型中鉴定了1351个基因，在B16F10模型中鉴定了950个基因，这些基因在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中比在Mock肿瘤中高表达。基因组A和B之间的重叠基因由293个基因。对这293个基因的通路分析确定了“FGFR2配体结合和激活”通路。另外，该途径在每个单独的基因组中被列为最主要的信号传导途径。这些结果表明，RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc肿瘤中的FGFR2信号通路被激活，这是针对抗VEGF治疗的常见获得性耐药机制。
然后，经营印度仿制药的药神网在RNA-Seq数据中检查了FGF配体和FGF受体的mRNA水平。与途径分析的结果一致，在Renca和B16F10模型中，表达VEGFR2-Fc的肿瘤中Fgf2和Fgfr2mRNA的表达水平通常高于模拟肿瘤。当经营印度仿制药的药神网检查与肿瘤血管生成有关的其他基因时，经营印度仿制药的药神网发现在这两个模型中均没有一致上调的促血管生成受体和配体。为了确认FGF配体和FGF受体的mRNA水平增加，经营印度仿制药的药神网进行了实时定量逆转录PCR分析。与RNA-Seq分析一致，在两种模型中，表达VEGFR2-Fc的肿瘤中的Fgf2和Fgfr2mRNA水平均显着上调。在Renca或B16F10模型中，其他一些FGF配体和FGF受体的mRNA水平也显着上调。为了检查表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤中FGFR2的活化状态以及FGF2和FGFR2的水平，经营印度仿制药的药神网对约500mm3切除的肿瘤的肿瘤裂解液进行了蛋白质印迹分析。与Renca和B16F10模型中的Mock肿瘤相比，FGFR2高度磷酸化，表达VEGFR2-Fc的肿瘤中FGF2水平上调，尽管FGFR2蛋白水平没有明显改变。因此，FGF2信号传导途径是参与对抗VEGF疗法的获得性抗性的候选者。
相反，在体外模拟表达和VEGFR2-Fc表达的肿瘤细胞之间，Fgf2mRNA表达水平没有显着差异，并且未检测到Fgfr2mRNA表达。该结果表明，在体内表达VEGFR2-Fc的肿瘤中观察到的Fgf2和Fgfr2mRNA的增加可能是由于基质细胞包括内皮细胞，周细胞，与癌症相关的成纤维细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞而不是癌细胞。
为了研究上调FGF2激活FGFR2信号通路的机制，经营印度仿制药的药神网在Mock和VEGFR2中使用抗FGF2Ab，抗CD31Ab和抗SMAAb进行了免疫荧光染色。Fc表达肿瘤。在表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤中均观察到CD31染色。相反，在RencaMock或B16F10Mock肿瘤中几乎未观察到SMA染色和FGF2染色，但在RencaVEGFR2-Fc和B16F10VEGFR2-Fc肿瘤中清晰可见。在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中，FGF2的强染色与蛋白质印迹分析的结果一致。有趣的是，SMA染色的细胞与CD31染色的细胞相邻，因此似乎与表达VEGFR2-Fc的肿瘤中的肿瘤内皮细胞对齐。此外，FGF2阳性区域也与CD31阳性细胞相邻，并且SMA阳性细胞可能与表达VEGFR2-Fc的肿瘤中FGF2阳性区域共定位。这些结果表明，通过长期用VEGFR2-Fc治疗改变了肿瘤微环境，并且抗VEGF治疗的肿瘤血管被周细胞覆盖，周细胞产生FGF2以激活FGFR2信号通路。
为了进一步检查在肿瘤微环境中哪种细胞类型表达FGF2和FGFR2，经营印度仿制药的药神网分离了CD31+细胞，Thy-1阳性细胞和CD45阳性。通过使用包被有各自抗体的微珠，肿瘤细胞是肿瘤基质细胞的主要成分。然后从分离的细胞中收集总RNA，并通过RT-qPCR分析Fgf2，Fgfr2，Pecam1，Acta2和Ptprc的mRNA水平。虽然CD45+的一小部分通过分离抗CD31和抗Thy-1微珠非特异性地包括了细胞，结果证实了微珠主要富集了预期的细胞群。分离的Thy-1+细胞显示出高表达的Acta2mRNA，这与周细胞20预期的一样。因为在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中SMA+细胞主要与CD31+细胞相邻，所以经营印度仿制药的药神网将Thy-1+细胞视为周细胞。在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中，分离的CD31+细胞显示出明显高于在模拟肿瘤中的Fgfr2mRNA表达，而分离的Thy-1+细胞在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中显示出更高的Fgf2mRNA表达。对于CD45+细胞，在Renca肿瘤模型中，表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤之间的Fgf2和Fgfr2mRNA水平没有显着差异。在B16F10模型中，对于CD45+细胞，与表达模拟的肿瘤相比，表达VEGFR2-Fc的肿瘤的Fgf2mRNA水平显着上调，而表达的Fgfr2mRNA水平则下降，尽管水平变化很小。这些结果表明，周细胞是在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中产生FGF2的主要细胞类型。因此，由周细胞提供的FGF2可以以并列方式有效地激活内皮细胞中的FGFR2，并在获得的抗性模型中诱导抗VEGF疗法的逃逸途径。
为了检查FGF信号在表达VEGFR2-Fc的体内肿瘤生长中的作用，经营印度仿制药的药神网建立了Renca和B16F10肿瘤细胞，它们过度表达FGFR2-Fc。收集表达Mock和FGFR2-Fc的肿瘤细胞的细胞培养上清液，以评估FGFR2-Fc与FGF1和FGF2的特异性结合。FGFR2-Fc蛋白与FGF1和FGF2特异性相互作用，但不与VEGF相互作用。此外，在HUVEC夹心管形成试验中，HUVEC与表达FGFR2-Fc的肿瘤细胞共培养时，FGFR2-Fc可显着抑制FGF2诱导的管形成。在通过VEGF+FGF2诱导HUVEC的管形成的类似试验中，通过与表达VEGFR2-Fc–或FGFR2-Fc的肿瘤细胞共同培养部分破坏了管的形成通过与表达VEGFR2-Fc–和FGFR2-Fc的肿瘤细胞的混合物共同培养。这些结果表明，VEGFR2-Fc和FGFR2-Fc的组合在体外抑制了VEGF+FGF2诱导的HUVEC管形成。
接下来，经营印度仿制药的药神网通过在Renca和B16F10模型中接种表达Mock，表达VEGFR2-Fc或表达FGFR2-Fc的肿瘤细胞的各种组合到同系小鼠中，检查了体内肿瘤的生长和肿瘤血管生成。在两种模型中，接种表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤细胞混合物比单独接种Mock细胞产生的体内肿瘤生长显着更慢。接种表达Mock和FGFR2-Fc的肿瘤细胞混合物后，体内肿瘤的生长与Renca模型中单独的Mock细胞相似，但比B16F10模型中单独的Mock细胞慢。该结果表明体内B16F10肿瘤的肿瘤生长部分取决于FGF信号通路。与接种表达Mock和VEGFR2-Fc的肿瘤细胞的混合物相比，接种表达VEGFR2-Fc和FGFR2-Fc的肿瘤细胞表现出更大的体内肿瘤生长延迟。与体外HUVEC管形成试验的结果一致，与上述其他组合相比，在表达VEGFR2-Fc–和FGFR2-Fc的肿瘤细胞混合物形成的肿瘤中，肿瘤血管生成得到了强烈抑制。Mock和表达FGFR2-Fc的肿瘤细胞的二维体外肿瘤生长速率彼此相似。在分别表达VEGFR2-Fc或FGFR2-Fc的肿瘤中，VEGFR2-Fc与VEGF特异性相互作用，而FGFR2-Fc与FGF1和FGF2选择性相互作用。两者合计，这些结果表明，与Renca和B16F10模型中单独抑制VEGF或FGF信号相比，同时抑制肿瘤中的VEGF和FGF信号通路可通过增强肿瘤血管生成抑制作用进一步导致体内肿瘤生长的进一步延迟。
乐伐替尼（lenvatinib）是多酪氨酸激酶抑制剂，其示出了针对VEGFR和FGFR双重抑制。相反，索拉非尼是针对VEGFR而非FGFR的酪氨酸激酶抑制剂。与由VEGF加FGF2诱导的内皮细胞的夹层管形成测定中，抑制乐伐替尼（lenvatinib）管形成，索拉非尼和需要更高的浓度来抑制管的形成。乐伐替尼（lenvatinib）和sorafenib都需要更高的浓度来抑制RencaMock，RencaVEGFR2-Fc，B16F10的体外增殖模拟，并比B16F10VEGFR2-Fc肿瘤细胞抑制管形成。因此，乐伐替尼（lenvatinib）和sorafenib的体内抗肿瘤活性不太可能通过直接抑制癌细胞的增殖而产生。
经营印度仿制药的药神网接下来评价乐伐替尼（lenvatinib）的抗肿瘤活性，阿柏西普对模拟或VEGFR2-Fc的表达中的Renca和B16F10肿瘤模型，和索拉非尼。在这两种模型中，所有三种化合物均显着抑制了模拟肿瘤的生长。相反，只有乐伐替尼（lenvatinib）显着抑制表达VEGFR2-Fc的肿瘤的生长。为了评估乐伐替尼（lenvatinib），aflibercept和sorafenib的抗血管生成活性，将切除的肿瘤用抗CD31Ab染色。在两种模型中，所有三种化合物均抑制了模拟肿瘤中的肿瘤血管生成。相反，尽管阿柏西普和索拉非尼似乎略微抑制了肿瘤的血管生成，但乐伐替尼（lenvatinib）明显抑制了表达VEGFR2-Fc的肿瘤中的肿瘤血管生成。为了检查乐伐替尼（lenvatinib），aflibercept和sorafenib对表达VEGFR-Fc的肿瘤中FGFR2磷酸化的影响，经营印度仿制药的药神网使用切除的肿瘤的裂解物进行了蛋白质印迹分析。尽管aflibercept和sorafenib并未降低FGFR2的磷酸化，但在两种模型中，乐伐替尼（lenvatinib）均抑制了FGFR2的磷酸化。这些结果表明，FGF2信号传导途径的激活在逃逸机制中起作用，该逃逸机制是获得性抗VEGF治疗抗性的基础。
在这项研究中，经营印度仿制药的药神网证明了FGF2信号通路的激活是在两个小鼠肿瘤模型中获得的抗VEGF治疗耐药性的保守机制。在表达VEGFR2-Fc的肿瘤中，FGF2在紧邻表达FGFR2的内皮细胞的周细胞中表达。因此，在对抗VEGF疗法有抗性的肿瘤脉管系统中，内皮细胞与周细胞之间的FGF2信号传导途径可能在空间上有效激活。因为经营印度仿制药的药神网观察到在两种肿瘤模型中表达VEGFR2-Fc的肿瘤中均显着且一致地诱导了Fgfr2mRNA，所以经营印度仿制药的药神网集中于该受体。但是，经营印度仿制药的药神网还发现，VEGFR2-Fc的慢性表达显着上调了Renca模型中Fgfr3的mRNA水平和B16F10模型中Fgfr1和Fgfr4的mRNA水平，与以前的报告在肿瘤血管生成中起关键作用一致的。乐伐替尼（lenvatinib）抑制多种受体酪氨酸激酶，包括VEGFR和FGFR，具有类似的抑制活性对几种FGFR亚型。因此，需要进一步的分析来确定特定的FGFR亚型在内皮细胞对抗VEGF治疗的抗性中的作用。
周细胞覆盖的容器的数目已被报道提高以下的抗VEGF疗法，虽然通过这样的治疗后的周细胞覆盖的肿瘤血管的机制仍然是未知的。与这些报告一致，在长期暴露于VEGFR2-Fc之后，经营印度仿制药的药神网始终观察到Renca和B16F10模型中SMA+细胞与CD31+细胞共定位。因为经营印度仿制药的药神网观察到更少的SMA+在这两种模型中，模拟肿瘤细胞均比表达VEGFR2-Fc的肿瘤细胞长，这些细胞在长期暴露于抗VEGF治疗期间可能通过分泌因子从血液中募集到肿瘤微环境中，或者可能与肿瘤中的其他细胞类型区分开微环境。事实上，间充质干细胞，其来自骨髓衍生，是周细胞的公知的源极。肌成纤维细胞和内皮细胞也可以分化成周细胞。因此，为了改善抗VEGF疗法，需要进一步分析以了解将周细胞募集到肿瘤微环境中或将其他细胞类型分化为周细胞的潜在机制，以及FGF表达在周细胞中的作用。
在差异基因表达分析中，在Renca和B16F10模型中，没有其他受体或相关配体被一致地上调，但是在两个模型中PdgframRNA的水平均被显着上调。此外，与B16F10Mock肿瘤相比，B16F10VEGFR2-Fc肿瘤中的Angpt1和TekmRNA水平升高。PDGF-PDGFR信号通路有助于周细胞的迁移，和ANGPT1-TEK信号通路调节的血管周细胞通过和内皮细胞之间的串扰成熟。因此，经营印度仿制药的药神网的结果表明，抗VEGF治疗耐药肿瘤中的肿瘤血管比治疗前肿瘤中的更为成熟。的周细胞覆盖的容器用抗VEGF抗体和抗抗体VEGFR1治疗的频率增加，并且已经推测周细胞覆盖的容器是抗VEGF治疗有抗性。周细胞和内皮细胞之间的串扰被多个信号通路，如EFNB2-EPHB4调节，JAG1-NOTCH3的途径，以及所述ANGPT-TEK和PDGF-PDGFR上述途径。但是，仍然不清楚在周细胞或内皮细胞中选择性抑制这些信号通路是否能克服周细胞覆盖的血管对抗VEGF治疗的耐药性。经营印度仿制药的药神网的研究揭示了FGF2在周细胞中的新作用，以及在抗VEGF治疗耐药的肿瘤中肿瘤血管中FGF信号通路的激活。即使在VEGFR和FGFR的双重抑制之后，也没有实现完全的肿瘤生长抑制。为了进一步对抗抗血管生成疗法的耐药性，经营印度仿制药的药神网可能还需要抑制其他促血管生成途径：例如TEK，PDGFR，EPHB和NOTCH信号传导途径。经营印度仿制药的药神网的诱饵系统将有助于评估这些血管生成受体对肿瘤血管生成的贡献。
总之，肿瘤血管生成主要取决于VEGF信号传导途径。在长期接受抗VEGF治疗的过程中，VEGF依赖性血管受到抑制。然后，随着过度表达FGF2的被周细胞覆盖的肿瘤血管的数量增加，对肿瘤血管生成的FGF2信号传导途径的依赖性就出现了。因此，除了VEGF抑制剂外，还需要通过乐伐替尼（lenvatinib）等药物抑制FGFR，以最大程度地发挥抗VEGF治疗的作用。VEGFR和FGFR的双重抑制是乐伐替尼（lenvatinib）特有的一种作用方式：即，它不同于VEGF或VEGFR选择性抑制剂，针对VEGF或VEGFR2的抗体以及VEGF陷阱。经营印度仿制药的药神网的发现提供了对FGF2信号通路抑制对增强抗VEGF治疗，从而改善抗血管生成治疗的重要性的见解。 |
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