通过靶向AMPK途径抑制肝癌的发生 |
核苷酸结合寡聚结构域2是公认的先天免疫传感器，可以启动针对病原体的有效免疫反应。据报道，许多先天免疫传感器在致癌作用中非常重要。但是，NOD2在癌症中的作用尚不十分清楚。在这里，印度仿制药经营者药神网调查了NOD2在肝细胞癌发展中的作用。印度仿制药经营者药神网证明了NOD2缺乏促进N-亚硝基二乙胺/四氯化碳诱导的HCC小鼠模型和异种移植肿瘤模型。体外研究表明，NOD2起到抑癌作用，并抑制HCC细胞的增殖，集落形成和侵袭。临床研究表明，临床肝癌组织中NOD2表达完全丧失或显着下调，而NOD2表达的丧失与疾病的晚期阶段显着相关。进一步的研究表明，NOD2通过激活5'-单磷酸腺苷激活的蛋白激酶信号传导通路发挥其抗肿瘤作用，并且NOD2通过以下方式显着增强了HCC细胞对索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU治疗的敏感性激活AMPK途径诱导的细胞凋亡此外，印度仿制药经营者药神网证明了NOD2通过直接与AMPKα-LKB1复合物结合而激活了AMPK途径，导致自噬介导的HCC细胞凋亡。总而言之，这项研究表明，NOD2通过直接激活AMPK途径在HCC细胞中充当肿瘤抑制因子和化学治疗调节剂，这表明通过上调NOD2-AMPK信号传导轴可以为HCC治疗提供潜在的治疗策略。
肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率均增加。肝癌的治疗策略是相当有限的，由于电阻的对化疗的共同存在1，2。由于腺苷5'-单磷酸激活的蛋白激酶途径与多种癌症相关信号包括雷帕霉素复合物1哺乳动物靶标之间的关键联系，因此公认AMPK途径在癌症中起关键作用。AMPK途径的缺失报道在多种类型的癌症中促进癌症和电阻的进展对化疗药物。但是，癌症中AMPK途径失调的原因及其分子机制尚待阐明。在这项研究中，印度仿制药经营者药神网确定了一种先天性免疫传感器核苷酸结合寡聚域2作为AMPK途径的有效直接调节剂。并且其在癌细胞中的表达缺失促进了HCC进程和对化疗的耐药性。
NOD2是NOD样受体家族的成员，它被认为是胞质溶胶中细菌肽聚糖保守基序的传感器，以刺激随后的先天免疫应答。然而，最近的许多研究表明，先天免疫传感器，包括核苷酸结合结构域，富含亮氨酸的家族，含热蛋白和不存在于黑色素瘤2也参与了癌变。据报道，NOD2的失调与克罗恩病和结肠炎相关的结肠癌的发病机理有关。和NOD2基因多态性与淋巴瘤，结直肠癌，胃癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和喉癌的风险增加相关11。此外，据报道，NOD2激动剂可以激活驻留在肿瘤微环境中的免疫细胞的细胞毒性潜能，并因此促进它们与癌细胞的结合。但是，NOD2在肝癌中的确切作用仍远未阐明。
在这项研究中，印度仿制药经营者药神网表明先天性免疫传感器NOD2在HCC进展中起肿瘤抑制作用，并在体内和体外抑制肝癌发生。印度仿制药经营者药神网还显示，NOD2显着逆转了HCC细胞对化疗药物的耐药性。进一步的研究表明，NOD2可以通过直接结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK11-AMPK复合物并精细调节LKB1/AMPK途径来激活AMPK通路，从而进一步诱导随后的自噬介导的HCC细胞凋亡。因此，印度仿制药经营者药神网的研究为阐明参与HCC疾病进展和对化学治疗药物反应的分子机制提供了新线索，这表明通过调节NOD2/AMPK信号传导轴可以为HCC治疗提供一种可选的治疗策略。
NOD2缺乏促进了NOD2缺失小鼠的肝癌发生
为了验证是否NOD2起到HCC进展中的作用，印度仿制药经营者药神网通过注射构建HCC的动物模型和四氯化碳至NOD2。诱导后24周处死小鼠，分析和比较WT和NOD2小鼠的肿瘤形成状态。通过蛋白质印迹证实了NOD2小鼠中的NOD2缺乏。与野生型小鼠相比，NOD2小鼠的肿瘤数目，肝体比例和肿瘤直径显着增加，而NOD2小鼠的体重显着降低。HE染色显示，与WT小鼠相比，NOD2小鼠中的肿瘤分化程度较低。此外，与野生型小鼠相比，NOD2小鼠在肠系膜和肌中的转移灶更多，并且这些转移灶由两名专业病理学家通过病理分析进一步证实。这些数据共同表明NOD2缺乏促进肝癌发生并加剧了HCC的发展。
NOD2在体内和体外抑制HCC细胞恶性肿瘤
为了进一步验证NOD2在肝癌中的作用，异种移植肿瘤模型的构建如之前所述14。可见肿瘤出现后，将形成的肿瘤用针对NOD2的特异性小干扰RNA转染，以按照15所述的方法在体内构建功能丧失模型。第一次转染后第38天处死小鼠，并统计分析形成的肿瘤。与Si-NC转染的组相比，Si-NOD2转染的组中形成的肿瘤的体积和重量均显着增加。实时聚合酶链反应和Western印迹分析表明，Si-NOD2转染组中NOD2的成功敲低，这证实了NOD2表达的丧失加剧了肝癌的发生。在另一组平行实验中，将形成的肿瘤用NOD2表达质粒转染，以构建裸鼠的功能获得模型。处死小鼠并在第一次注射质粒后第21天分离肿瘤。在这些形成的肿瘤中，NOD2转染组中的两个肿瘤完全消失。进一步的测定表明，与用模拟质粒转染的那些肿瘤相比，用NOD2质粒转染的肿瘤具有明显更小的肿瘤体积和更低的肿瘤重量。实时荧光定量PCR和Westernblot分析证实了NOD2质粒转染组中NOD2的成功过表达。因此，这些体内数据表明NOD2抑制了HCC小鼠模型中的异种移植肿瘤的生长。
为了验证NOD2对HCC的抗肿瘤作用，进一步分析了NOD2在HCC细胞模型中的功能。印度仿制药经营者药神网通过将NOD2质粒转染到NOD2表达水平较低的HepG2细胞来构建功能丧失的细胞模型，然后通过将Si-NOD2转染到具有较高水平的HUH7细胞中进一步构建功能丧失的细胞模型。NOD2表达的差异。在功能丧失模型中，通过Western印迹验证了三个Si-NOD2序列对NOD2的有效敲除。因此，以下两个具有较高抑制效率的Si-NOD2序列的混合物进行了NOD2敲低实验。印度仿制药经营者药神网的数据表明，敲除NOD2后，HCC细胞的增殖，侵袭和集落形成能力显着提高，而HCC细胞中NOD2的过表达抑制了这些恶性行为。胞壁酰二肽是一种公认的配体以及NOD2的先天免疫反应的激动剂16，印度仿制药经营者药神网有兴趣限定MDP是否有相同的抗肿瘤效果作为NOD2。印度仿制药经营者药神网的数据表明，与外源性NOD2过表达的影响相一致，MDP处理还可以抑制HCC细胞的恶性行为。总之，这些体外数据进一步支持了印度仿制药经营者药神网来自动物模型的数据，即NOD2在HCC进展中起着肿瘤抑制作用。
NOD2的缺乏表达有助于临床HCC进程
为了证明NOD2在临床HCC进程中的作用，在包括165对HCC组织和相应的远端非癌性肝组织在内的一个队列中，通过免疫组织化学检测了NOD2表达。然后采用蛋白质印迹和实时PCR检测另一组64例HCC组织和远端非癌性肝组织匹配患者的NOD2表达。IHC分析表明，与匹配的非癌性肝组织相比，HCC组织中的NOD2表达显着降低，平均光密度分析显示了相同的结果。对IHC染色的进一步分析表明，在具有晚期肿瘤淋巴结转移阶段的HCC患者中，NOD2表达显着降低。与IHC数据一致，定量实时PCR和Westernblot分析还显示，NOD2表达在肝癌组织中完全丧失或显着降低。进一步的统计分析表明，与分化程度高的HCC患者相比，分化状态较差的HCC患者倾向于显着降低NOD2表达水平。考虑到NOD2在动物和细胞模型中的抑癌作用，所有这些临床数据均表明，HCC患者中NOD2表达的丧失促进了HCC的发展。
NOD2通过激活AMPK信号通路抑制HCC进展
为了阐明NOD2在HCC细胞中的信号转导途径，测试了几种可能的参与途径，所有这些数据表明AMPK途径参与了NOD2对HCC细胞的作用。NOD2过量表达后，包括p-LKB1，p-AMPKα和p-AMPKβ在内的AMPK途径相关蛋白的激活显着上调，这表明AMPK途径显着激活。与功能获得数据一致，NOD2表达的敲低显着抑制了AMPK途径的磷酸化和激活。
NOD2诱导自噬介导的HCC细胞凋亡
在这项研究中，印度仿制药经营者药神网表明NOD2激活了AMPK途径并进一步抑制了随后的mTORC1途径。由于已知抑制mTORC1途径可诱导自噬，因此印度仿制药经营者药神网对确定NOD2对HCC细胞自噬的作用更感兴趣。检测包括Beclin-1，ATG12，ATG5，ATG7，ATG3和ATG16L1在内的ATG蛋白的表达水平以及LC3的脂质形式，以反映HCC细胞自噬的激活状态。如预期的那样，NOD2的过表达促进了HCC细胞中ATG蛋白的表达水平和LC3脂质形式，而敲低NOD2抑制了ATG蛋白的表达水平和LC3脂质形式。这些数据表明，NOD2显着诱导了HCC细胞的自噬。
自噬激活的结果有争议地报道，因此印度仿制药经营者药神网进一步感兴趣的是确定由NOD2诱导的自噬是否最终导致HCC细胞死亡。AnnexinV-PI染色显示NOD2的过表达可显着诱导HCC细胞凋亡。进一步的研究表明，NOD2诱导的Caspase9-Caspase3激活介导的内源性细胞凋亡途径。为了进一步验证HCC细胞的凋亡是否依赖于自噬，印度仿制药经营者药神网合成了两种针对ATG5的特异性SiRNA以抑制自噬过程。印度仿制药经营者药神网的数据表明，当自噬被阻断时，HCC细胞的凋亡也被显着抑制，这表明NOD2诱导的HCC细胞的凋亡是由自噬介导的。此外，印度仿制药经营者药神网还证明了DEN/CCl4诱导的HCC模型和异种移植HCC模型中NOD2诱导的自噬介导的细胞凋亡。总而言之，这些数据表明NOD2通过激活自噬介导的细胞凋亡对HCC细胞发挥抗肿瘤作用。
NOD2显着增强HCC细胞对索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU的化学敏感性
化疗耐药是改善晚期肝癌患者预后的主要障碍。NOD2施加其抗肿瘤作用通过AMPK途径的活化，而后者被认为是参与调节对化疗的响应;因此，印度仿制药经营者药神网有兴趣确定NOD2是否对HCC细胞对化学疗法的反应有任何影响。为了阐明这个问题，印度仿制药经营者药神网测试了NOD2对HCC细胞对三种化疗药物的反应：索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU。酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是FDA批准的晚期HCC患者的一线药物;而另一种TKI乐伐替尼（lenvatinib）也已于2018年8月被FDA批准为HCC的新一线治疗药物。5-FU是一种广泛使用的抗多种肿瘤的抗肿瘤药，它也常用于临床治疗肝癌。这三种类型的化学治疗药物通常用于HCC患者，印度仿制药经营者药神网感兴趣的是确定NOD2对HCC细胞对这些化学治疗药物反应的调节作用。
印度仿制药经营者药神网的数据表明，外源性NOD2的过表达可显着提高HCC细胞对索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU治疗的化学敏感性，进一步的研究表明NOD2显着促进了HCC细胞对HCC细胞的化学敏感性。索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU对HCC细胞的治疗作用。此外，在用索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU处理后，NOD2显着增加了HCC细胞的凋亡率。
为了进一步确定NOD2对化疗调节HCC细胞的分子机制，印度仿制药经营者药神网进行了蛋白质印迹分析，印度仿制药经营者药神网的数据显示，NOD2通过激活AMPK途径和抑制mTORC1途径并随后诱导，从而显着促进索拉非尼和乐伐替尼（lenvatinib）的作用。自噬介导的细胞凋亡。以上所有这些数据表明，NOD2通过调节AMPK途径显着增强了HCC细胞的化学敏感性。
NOD2通过与LKB1-AMPKα复合物直接结合来促进AMPK信号通路的激活
已知AMPKα与其上游活化剂LKB1形成复合物并被LKB1直接活化，因此印度仿制药经营者药神网有兴趣确定NOD2是否可以直接与AMPKα和LKB1相互作用。免疫共沉淀分析表明，NOD2可以与内源性LKB1和AMPKα蛋白结合。根据目前的报道显示AMPKα和LKB1通过形成复合物发挥其功能，印度仿制药经营者药神网的数据也显示AMPKα和LKB1蛋白之间的相互作用。免疫荧光染色显示HCC细胞中NOD2与LKB1和AMPKα共定位，并且体外蛋白翻译测定进一步证实NOD2与LKB1和AMPKα都直接相互作用。总而言之，这些数据表明NOD2通过与LKB1和AMPKα直接相互作用而直接激活AMPK途径，从而在HCC细胞中形成NOD2-LKB1-AMPKα复合物。
将HUH7细胞培养24小时，然后获得细胞裂解物进行IP分析。通过使用指定的抗体通过IP分析检测NOD2和LKB1/AMPKα，LKB1和NOD2/AMPKα以及AMPKα和NOD2/LKB1之间的内源性相互作用。bHUH7细胞在24孔板中培养24小时，然后将其固定并用抗NOD2和AMPKα/LKB1的一抗染色，然后用荧光偶联的二抗染色。DAPI用于染色细胞核，合并面板中NOD2和AMPKα/LKB1之间的共定位显示为黄色荧光。c–d从体外翻译系统获得NOD2，AMPKα和LKB1蛋白。将NOD2蛋白与AMPKα或LKB1蛋白混合，通过IP分析检测NOD2与AMPKα，NOD2和LKB1的直接结合。所提供的所有数据均为来自至少三个独立的三次重复实验的代表性数据。该工作模型显示了NOD2在HCC细胞中的作用和机制。NOD2与LKB-AMPKα复合物直接结合，进一步激活LKB1-AMPKα途径，从而抑制mTORC1途径并激活HCC细胞自噬介导的凋亡。因此最终逆转了HCC细胞的恶性行为，并增强了HCC细胞对索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）和5-FU的化学敏感性。总之，NOD2在HCC细胞中起着抑癌作用，在临床HCC患者中其表达的丧失促进了HCC的发展。
总而言之，这些数据共同证明了NOD2通过激活AMPK途径并诱导自噬介导的HCC细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用，从而最终逆转了HCC细胞的恶性行为并增强了HCC细胞对索拉非尼，乐伐替尼（lenvatinib）的化学敏感性。和5-FU处理。
NOD2被公认为枢轴先天免疫传感器，其可以感测病原体感染和随后的诱导先天免疫应答中的一个。许多最近的研究表明，先天免疫传感器也极为参与癌症的进展，这表明先天免疫和恶性之间的电位有效的链路。
在这项研究中，印度仿制药经营者药神网调查了NOD2在HCC发病机理中的作用，并表明NOD2缺乏促进肝癌发生，而NOD2的过表达抑制肿瘤发生和对化学疗法的耐药性，这表明NOD2对HCC具有抗肿瘤作用。通过直接调节AMPK途径，印度仿制药经营者药神网进一步验证了NOD2在HCC细胞中具有抑癌作用以及对化学敏感性的有效调节作用。
AMPK是许多细胞过程中高度保守的主调节剂，在应激过程中被高度激活。因为AMPK位于包括LKB1，TSC1-TSC2复合体和p53在内的多个已建立的肿瘤抑制网络的中心，所以人们认为AMPK在癌症进展中起着举足轻重的作用。AMPK途径的缺陷是已知与癌症的发展相关联的几种类型的癌症,因此，众所周知，有效激活AMPK途径是一种有效的癌症治疗策略。在这项研究中，印度仿制药经营者药神网首次证明NOD2是HCC细胞中AMPK途径的有效直接激活剂，这表明它具有巨大的治疗癌症的潜力。公认的HCC对化学治疗药物具有高度抵抗力，这导致其不可控的发展和对晚期疾病的有效治疗缺乏。迫切需要克服化学抗药性并抑制HCC患者的癌症进展。由于AMPK途径失调通常涉及电阻对化疗药物在几种类型的癌症,因此，可以预期的是，NOD2在对化学疗法的抗性中具有调节作用。因此，印度仿制药经营者药神网测试了NOD2对HCC细胞对化疗药物反应的影响，并且印度仿制药经营者药神网发现NOD2可以显着提高HCC细胞对最常用的化疗药物的化学敏感性。进一步的研究证实，NOD2通过激活AMPK通路并进一步诱导HCC细胞凋亡来调节HCC细胞的化学敏感性。因此，该研究表明NOD2在临床上具有增强肝癌化疗药物治疗效率的巨大潜力。
NOD2对AMPK途径的调控已在本研究中进行了定义，印度仿制药经营者药神网对阐明该调控过程中的分子机制感兴趣。AMPK的活化，已知通过形成复合物含有LKB1，其突变或沉默在各种癌症中的已知肿瘤抑制被有效地诱导。LKB1的许多最广为人知的功能归因于其激活AMPKα的能力，这进一步对包括细胞生长在内的多个细胞过程发挥了作用。免疫沉淀分析表明，NOD2可以与AMPKα和LKB蛋白结合。进一步的体外蛋白质翻译实验确定，NOD2可以在体外与AMPKα和LKB1蛋白质直接相互作用。因此，印度仿制药经营者药神网的数据表明，NOD2通过直接与AMPKα和LKB1相互作用并进一步形成NOD2-LKB1-AMPKα复合物来诱导AMPK通路活化，从而对HCC细胞发挥抗肿瘤作用。从示出了NOD2通过在先天性免疫应答调节免疫相关的GTPase家族的M蛋白间接地激活AMPK的报告不同，印度仿制药经营者药神网的研究证实了第一次NOD2直接相互作用与AMPKα和进一步形成NOD2-LKB1-AMPKα复合物诱导AMPK途径的激活。
为了进一步阐明NOD2诱导的AMPK途径活化的后果，印度仿制药经营者药神网检测了其下游mTORC1途径以及可能的后续表型，包括自噬和凋亡。印度仿制药经营者药神网的数据表明，NOD2通过调节AMPK途径显着抑制mTORC1途径，最终导致自噬介导的HCC细胞凋亡。自噬是在响应于应力蜂窝自降解过程，它已在近年被广泛研究。尽管自噬的生存和凋亡作用在癌症中都有报道，但近年来人们认识到肝癌的发展主要归因于肝实质细胞自噬的缺乏。自噬和细胞凋亡之间的关系在不同的研究中有所不同，并且它们复杂的调控参与了癌症的发展。在这项研究中，印度仿制药经营者药神网表明NOD2可以诱导自噬并进一步促进自噬介导的HCC细胞凋亡。因此，印度仿制药经营者药神网证明了NOD2在HCC细胞自噬和凋亡过程中的调节作用，因此定义了NOD2对HCC细胞的促凋亡死亡作用。
NOD2在癌症免疫中的作用是有争议的报道，它的变化取决于类型的癌症。NOD2是先天免疫系统的重要组成部分，在增强针对癌细胞的免疫反应方面，它构成了有趣的调控目标。因此，合成了几种具有良好抗癌活性的NOD2激动剂。但是，另一项研究表明，NOD2拮抗剂同时抑制NF-κB和MAPK炎症信号，并对紫杉醇起到辅助作用，从而抑制Lewis肺癌的生长。此外，据报道，MDP类似物可以抑制骨髓来源的抑制细胞的募集，发挥其抗肿瘤作用。这些差异报告可能是由不同类型的癌症和TME的不同背景引起的。NOD2据报道巨噬细胞和某些类型的癌症的活化NF-κB和MAPK途径，然而，在HCC细胞中，主要是NOD2活化AMPK通道和通过施加AMPK途径其抗肿瘤作用。首次报道了NOD2抑制肿瘤和增加HCC的化学敏感性的有利作用，这可能表明基于NOD2的调节，针对HCC的新治疗策略。
总之，印度仿制药经营者药神网调查了NOD2在包括动物模型，细胞模型和临床标本在内的综合调查系统中的作用，并证明了NOD2在HCC细胞中起着抑癌作用。印度仿制药经营者药神网证实，NOD2通过直接形成NOD2-LKB1-AMPKα复合物并进一步激活AMPK通路来抑制HCC进程并增强化学敏感性，最终导致自噬介导的HCC细胞凋亡。因此，印度仿制药经营者药神网首次将NOD2鉴定为HCC细胞中的新型肿瘤抑制物和化学治疗调节剂，这表明通过NOD2的正向调节，HCC的潜在治疗策略。 |
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