肝癌是全世界的主要恶性肿瘤，是与癌症相关的死亡的第四大原因。肝细胞癌约占原发性肝癌的90％。当前，手术切除和肝移植是早期肿瘤患者最有效的治疗方法。但是，大多数HCC患者在诊断时不符合手术条件。由于缺乏针对关键依赖性的药物，因此很难治疗肝癌。HCC中最经常发生的突变目前难以理解。索拉非尼是口服的多激酶抑制剂，代表晚期肝癌患者的标准疗法。索拉非尼被认为通过阻断raf原癌基因，血管内皮生长因子，血小板衍生生长因子和KIT原癌基因信号传导途径发挥抗增殖和抗血管生成作用。但是，该药物仅对晚期肝癌患者的中位总生存期提供少于3个月的获益。
　　 更好地了解肝癌的关键依赖性和潜在的分子机制，可能为肝癌患者提供更有效的治疗方法。RNA干扰遗传筛选已成功用于在临床前模型中识别潜在的肿瘤抑制因子，耐药性机制，新颖的可靶向依赖性和有效的联合方法。对于肝癌，已通过索拉非尼和MAPK14抑制作用的组合验证了“合成致死性”的概念，这种抑制作用已通过体内RNAi筛选确定。通过使用类似的平台，极光激酶A被鉴定为TP53突变肝癌中的可作用药物靶标。与基于shRNA的基因筛选相比，聚类的规则间隔的短回文重复技术具有多个优势，包括低噪音，最小的脱靶效应和始终如一的高效率。利用基于CRISPR-Cas9的功能筛选系统，关注印度仿制药的药神网先前发现细胞周期蛋白依赖性激酶抑制是具有高MYC表达的HCC肿瘤的脆弱性，并提供了索拉非尼和MEK抑制联合使用的证据可以有效治疗具有p细胞外信号调节激酶激活的肝癌，这种情况在大约30％的肝癌中可见。
　　 在这项研究中，关注印度仿制药的药神网确定了细胞周期蛋白依赖性激酶12是肝癌增殖所必需的。已显示含有CDK12和CDK13的复合物在转录延伸，mRNA剪接和3'-端RNA加工中起关键作用。以前的研究还表明，用THZ531抑制CDK12/13会大大降低与超级增强子相关的关键转录因子基因和DNA损伤反应基因的表达。CDK12/cyclinK复合物通过调节DNA损伤反应基因的表达来维持基因组稳定性。此外，CDK12的耗竭，而不是CDK13的耗竭，抑制了DNA损伤反应的几个成员的表达。在尤文氏肉瘤EWS-FLI癌基因阳性尤文肉瘤中，CDK12抑制作用也是致命的。最后，CDK7/12抑制剂THZ1的转录抑制被认为是一种有前途的策略，可以阻止靶向治疗诱导的转录程序和耐药性癌细胞群在治疗过程中的出现。
　　 在这里，关注印度仿制药的药神网报告说，HCC细胞使用CRISPR/Cas9遗传筛选对CDK12有很大的依赖性，并通过药理抑制编码的蛋白来验证这一发现。介导HCC细胞对CDK12抑制剂敏感性的潜在分子机制可能部分源于其优先抑制DNA修复相关基因的表达。此外，CDK12抑制剂通过抑制对该药物的适应性反应，使HCC细胞对索拉非尼治疗敏感。
　　 为了设计kinomeCRISPR文库，选择了5971个靶向504个人类激酶的gRNA，10个必需基因和50个非靶向gRNA。带有侧翼为衔接子的gRNA序列的寡核苷酸是从CustomArray订购的，并通过GIBSON组装体在LentiCRISPRv2.1中克隆为一个库。通过慢病毒转导将kinomeCRISPR文库引入Hep3B和Huh7细胞。将稳定表达gRNA的细胞培养14天。通过Illumina深度测序确定合并样品中每个gRNA的丰度。如前所述，使用MAGeCK通过与T0样品相比丰度的倍数减少来选择优先用于进一步分析的gRNA。
　　 HCC标本取自中国第二军医大学东方肝胆医院的230例接受手术治疗的患者。患者未接受任何术前抗癌治疗。如前所述对CDK12进行免疫组织化学染色。两名不了解患者特征的病理学家独立评估了免疫组织化学评分。根据百分比分数×强度分数评估免疫染色分数。
　　 HCC是一种缺乏有效治疗方法的高度侵袭性癌症。目前，HCC中最常见的突变是不可吸收的，这限制了靶向疗法的发展。因此，迫切需要为HCC开发基于分子的新型靶向疗法。在这里，关注印度仿制药的药神网发现CDK12是肝癌细胞系至关重要的必需品，它通过使用基于激酶的gRNA文库进行基于CRISPR的筛选。与在细胞周期不同阶段之间的过渡调控中起作用的CDK相反，CDK12通过在Ser2和Ser5处磷酸化RNA聚合酶II，在转录起始和延长中起关键作用。最近的研究表明，对CDK12的抑制作用可抑制几种同源重组基因的表达。基因组不稳定性是大多数癌症的特征。有吸引力的是，抑制剂可以对基因组不稳定性起作用。在关注印度仿制药的药神网的研究中，THZ531作为单一药剂可以强烈抑制整体基因表达，尤其是涉及DNA损伤修复的基因。发现9种HCC细胞系中有7种对THZ531治疗敏感，这突出了CDK12作为HCC药物靶标的临床潜力。CDK12调节同源重组基因的机制仍不清楚。一些专家发现CDK12在全球范围内抑制内含子聚腺苷酸化事件，从而使全长基因产物的产生成为可能。同源重组基因对CDK12抑制敏感，因为其中许多基因都具有更多的内含子聚腺苷酸化位点。
　　 已经在许多癌症类型中检测到CDK12基因的基因组改变，范围从5％到15％。基于CDK12的基因转录的调节的特定效应，失活CDK12基因已用独特基因组不稳定性的图案相关联。在卵巢癌和HER2阳性乳腺癌中，CDK12失活突变足以使癌细胞对PARP1抑制敏感。还确定了一些特定的遗传或细胞环境，包括MYC依赖性，CHK1抑制和EWS/FLI重排，这些增强了对CDK12抑制的敏感性。此外，CDK12失活描述了可以从免疫检查点免疫疗法中受益的不同类型的晚期前列腺癌。在这里，关注印度仿制药的药神网没有观察到CDK12抑制剂与DNA损伤剂之间明显的协同作用，这表明这些协同作用取决于环境。
　　 出乎意料的是，索拉非尼和雷戈非尼通过诱导细胞凋亡或衰老，在MHCC97H和SNU449细胞中与THZ531具有强协同作用。索拉非尼是过去10年中晚期肝癌患者的标准疗法，但只能为患者提供适度的生存益处。大量研究表明，索拉非尼疗法诱导的适应性生存信号转导可能导致药物耐受状态。例如，PI3K/AKT信号通路的激活介导了HCC细胞对索拉非尼的获得性耐药。几种RTK，例如EGFR/HER-3，胰岛素样生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体也与索拉非尼敏感性密切相关。在关注印度仿制药的药神网的研究中，关注印度仿制药的药神网发现与THZ531联合治疗会严重损害索拉非尼诱导的EGFR，c-MET和DDR1的反馈再激活。只有EGFR，c-MET和DDR1抑制剂的混合物才能使HCC细胞对索拉非尼敏感，这表明对索拉非尼治疗的适应性反应可能源自不同受体酪氨酸激酶的串扰。
　　 关注印度仿制药的药神网当前的工作表明，CDK12是肝癌细胞增殖的关键条件，而在肝癌生物学背景下尚待探索。从机制上讲，DNA修复相关基因优先被THZ531抑制，然后在HCC细胞中诱导强烈的DNA损伤。此外，THZ531损害索拉非尼治疗诱导的适应性反应，这可能为肝癌患者提供新的联合治疗策略。口服生物可利用的CDK12抑制剂的开发可能会使其在不久的将来在肝癌中进行临床评估。