肝癌是最致命的疾病之一，是癌症的第五最常诊断类型和世界癌症死亡的第二大原因。由于通常仅在晚期诊断出HCC，因此许多患者不适合进行肝移植或手术切除。尽管对更好的治疗选择进行了多年的深入研究，但迄今为止唯一的成功就是发现了多激酶抑制剂索拉非尼，该药物现已成为抗晚期HCC的标准疗法。尽管它对几种与癌症相关的蛋白激酶靶标具有明确的作用机制，但对人类肿瘤中索拉非尼反应的变异性仍知之甚少。因此，迫切需要寻找由索拉非尼介导并影响其在肿瘤细胞中的细胞生长抑制反应的特定细胞信号传导途径，从而潜在地提高药物对HCC细胞的功效和特异性。癌症的特征是细胞生长和增殖不受控制，因此对相关组成部分的需求量很高。为了满足这些巨大的需求，癌细胞的新陈代谢发生了重大变化。例如，脂质代谢经历朝向脂质生物合成发生了巨大变化。而正常细胞吸收外源游离脂肪酸，作为脂质积木，肿瘤细胞中产生它们自己的FA，因此取决于它们的从头合成。FA合成的高速率在很大程度上归因于肿瘤细胞表现出的加速脂肪生成。
　　 为了维持这些增加的脂肪酸合成速率，产生饱和FA的酶；乙酰辅酶A羧化酶1和FA合酶;和不饱和的FA，FA去饱和酶2，和硬脂酰辅酶A去饱和1经常在恶性细胞中过表达，并且这些酶的选择性抑制转化为抗癌活性在体外。FA合成增加可能使癌细胞更快生长。在脂肪生成途径中，SCD1与其他主要的脂肪生成酶协同作用。单不饱和的FA的合成具有额外的好处，因为它已经显示，油酸盐，SCD1的主要产物，可以保护细胞免受过量的饱和的FA和其它细胞应激毒性。此外，不饱和脂肪酸对所有哺乳动物细胞都是至关重要的，因为需要它们的结构特性来维持最佳的细胞膜流动性。因此，SCD1已被确定为癌症治疗的合理靶标，但是在实验室中显示抑制其活性的药物尚未转化为临床药物。
　　 AMPK是细胞能量水平的关键传感器，可协调多种代谢途径以维持能量稳态，在肝癌组织中表达失调。AMPK将葡萄糖可利用性的变化和能量的波动转化为雷帕霉素的哺乳动物靶标，从而响应能量压力来调节细胞活性。肝癌患者的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR水平升高，这与未分化的肿瘤，较早的肿瘤复发和较差的生存结果相关。甾醇调节元件结合蛋白1是关键的脂肪生成转录因子，它通过激活FA合成中涉及的基因来优先调节脂肪形成过程。先前的研究表明，肝细胞中AMPK和SREBP1的活性呈负相关。在这项研究中，关注泰瑞沙的药神网通过蛋白质组和脂质组分析研究了索拉非尼对人肝癌细胞脂质代谢的影响。关注泰瑞沙的药神网证明索拉非尼阻碍了新生FA的生物合成可能是通过主要脂肪生成酶的下调来实现的。外源添加油酸酯减轻了索拉非尼引起的线粒体功能障碍和细胞死亡。此外，显示ATP-AMPK-mTOR-SREBP1信号传导途径与索拉非尼引起的脂肪生成失调有关，因为用化合物C或ATP和腺苷进行治疗可阻止SCD1的耗竭。索拉非尼治疗后Huh7.5细胞中的血红蛋白水平升高。关注泰瑞沙的药神网的结果强烈表明，索拉非尼通过干扰ATP-AMPK-mTOR-SREBP1途径靶向SCD1，从而破坏脂质的生物合成并触发肝癌细胞死亡。
　　 索拉非尼由Solarbio提供，溶于DMSO中至100mM，并保存在-80°C。罗斯威尔公园纪念学院1640购自赛默飞世尔科技。胎牛血清购自PANBiotech。细胞内ATP检测试剂盒和MitoTrackerRedCMXRos由Beyotime生物技术研究所提供。碘化丙啶购自南京基恩生物技术有限公司。ECL基板由ThermoFisherScientific提供。抗B-微管蛋白，FASN，FADS2，细胞色素c，ACC1和SREBP1的抗体可从Proteintech获得。针对SCD1，磷酸化-ACCl，AMPKα，p-AMPKα，mTOR和p-mTOR的抗体购自Abcam。A939572来自ApexBio。化合物C，ATP和腺苷由Solarbio提供。油酸盐是MilliporeSigma的产品。实验中使用的所有其他试剂均为分析纯或更高。Huh7.5细胞在含10％FBS，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养。在含有10％FBS，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM中培养HepG2细胞和Bel‐7402细胞。所有实验均在第2代和第5代之间使用同一批次的细胞系进行。通过用PBS冲洗细胞后，通过用无葡萄糖培养基替代细胞培养基来实现葡萄糖剥夺。无葡萄糖的培养基是葡萄糖缺乏的RPMI-1640和补充有10％FBS的DMEM。
　　 蛋白质组学分析是使用PTMBiolabs进行的。简而言之，将Huh7.5细胞用25uM索拉非尼处理0、24和42小时，然后通过离心收集细胞并裂解以获得总细胞蛋白。然后通过液相色谱串联质谱对蛋白质样品进行消化，标记，分离和定量。然后进行蛋白质注释，功能分类，功能富集和聚类分析的生物信息学分析。所有质谱数据已通过蛋白质组学标识合作伙伴存储库。使用HemI软件绘制热图。与索拉非尼孵育指定的时间后，通过胰蛋白酶消化和离心收集Huh7.5细胞，HepG2细胞和Bel‐7402细胞，用冰冷的PBS洗涤两次，然后用RIPA缓冲区。然后，将蛋白质样品在6-12％SDS-PAGE凝胶上分离，电转移到硝酸纤维素膜上，与一抗和二抗孵育，最后用ECL检测。根据制造商的规程，使用Tripure试剂从Huh7.5细胞中提取总RNA。RNA质量使用NanoDrop2000测量的A260/280-nm和A260/230nm-比率进行评估。使用RT试剂盒以DNaseI处理的总RNA作为模板合成cDNA。PCR产物经过凝胶纯化，用限制酶消化，并连接到pmax载体中。将构建的质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并通过测序确认克隆的基因。
　　 将Huh7.5细胞，HepG2细胞和Bel‐7402细胞用表达载体，按照制造商的规程使用转脂转染胺。简而言之，转染前1d将细胞培养在6孔板上。转染前，将所有试剂均置于室温下，并将总质粒稀释至无FBS的RPMI-1640中。将Translipofectamine加入稀释的质粒溶液中，并涡旋混合。在室温下孵育15分钟后，将质粒/-translipofectamine混合物添加到培养的细胞中。转染后48h收集转染的细胞，并提取蛋白质。蛋白质样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，电转移到硝酸纤维素膜上，与抗SCD1/SREBP1c的一抗和二抗孵育，并通过ECL检测。索拉非尼对肝癌细胞的细胞毒性是通过3--2-，5-二苯基四唑溴化物方法确定的。简而言之，6×103将对数生长的肝癌细胞放在37℃的96孔板中培养24小时。然后，在指定的时间内用各种试剂处理细胞。加入MTT溶液，再孵育4小时。向每个孔中添加DMSO，以缓慢摇动10分钟以溶解甲maz的紫色晶体，并通过多检测酶标仪读取490nm的光密度。相对细胞生存力以相对于对照组的百分比表示。所有实验进行3次。使用CalcuSyn软件计算组合指数。
　　 使用Profleader进行脂质组学分析。简而言之，将Huh7.5细胞用25uM索拉非尼处理0、24和42小时，然后将细胞用冰冷的甲醇快速淬灭，收集并转移至80°C的冰箱中。从细胞裂解物中提取脂质。然后，将脂质样品在氮气下干燥，并在配备PhenomenexKinetexC18色谱柱的Agilent1290超高性能液相色谱系统上进行分离。在配备DuoSpray离子源的混合四极杆飞行时间质谱仪上以正离子模式分析洗脱液。为了产生可溶性FA储备液，将油酸酯与不含FA的牛血清白蛋白复合，如前所述。创建了1.5mMBSA的车辆控制库存。用索拉非尼和增加量的油酸盐处理细胞。48小时后，使用MTT方法测量细胞活力。
　　 通过碘化丙锭排除来确定细胞死亡。根据方案检测细胞色素c的释放。简而言之，将细胞铺在玻片上，用不同的实验条件处理，在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟，然后用0.2％TritonX-100透化5分钟。用5％BSA的PBS封闭1小时后，将细胞与抗细胞色素c抗体在封闭缓冲液中于4°C孵育过夜。第二天，洗涤细胞并与二抗孵育1小时。洗涤3次后，将细胞再用DAPI染色10分钟。使用LeicaLSM710共焦激光扫描显微镜获得图像。根据标准差速离心程序分别在4°C下以1000g，10,000g和7000g的条件制备10分钟的Huh7.5细胞的细胞线粒体。然后用RIPA缓冲液裂解线粒体，并将提取的蛋白质样品在12％SDS-PAGE凝胶上分离。
　　 GenePharma合成了针对人SCD1的RNA干扰序列和。无义对照小干扰RNA购自GenePharma，并用作RNAi阴性对照。根据制造商的方案进行转染。简而言之，将Huh7.5细胞接种到24孔板中，融合度为30-50％。将靶向和对照的siRNA和siRNA-Mate稀释在100ulOpti-MEM中，并立即涡旋振荡。在室温下孵育10分钟后，将转染复合物添加到含有500ulsiRNA终浓度为100nM的培养基的孔中。48小时后，通过蛋白质印迹确定靶蛋白的表达水平。仅将具有显着击倒的靶蛋白的细胞用于实验。将Huh7.5细胞接种在玻璃底培养皿中进行活细胞显微镜测量。用指定的处理温育后，在37°C的细胞中加入500nMMitoTrackerRedCMXRos30分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜LSM710进行了进一步分析。
　　 经过指定的处理后，将Huh7.5细胞固定在2.5％的戊二醛中，并用1％的四氧化os和铁氰化钾固定在尾dy酸盐缓冲液中固定。随后，将细胞按照酒精系列进行脱水，然后包埋到Epon中。将超薄切片收集在formvar涂层的网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅复染，然后用透射电子显微镜观察。
　　 根据制造商的说明，使用细胞内ATP检测试剂盒测量细胞ATP水平。将接种在12孔板中的Huh7.5细胞与索拉非尼在指定浓度下孵育。然后，将细胞用PBS冲洗3次，并在冰冷的ATP裂解缓冲液中匀浆。在4°C下离心10分钟后，将每个样品的上清液与等体积的ATP分析缓冲液合并；然后，立即使用多检测酶标仪测量化学发光水平。在完全培养基中用DMSO处理的细胞的ATP水平视为100％。BALB/cnu-nu雄性小鼠是从北京生命河实验动物技术有限公司获得的。将小鼠关在笼子里，在12小时的明暗循环中，温度为22±3°C，可以自由进食和饮水。所有的小鼠研究均得到中国科学院海洋研究所动物实验动物研究所的批准。遵守伦理委员会的动物护理和使用指南。将总共3×10Huh7.5细胞皮下注射到每只裸鼠的右前肢中。肿瘤大小达到约100mm3时开始每日药物治疗并继续进行以下2周的操作。索拉非尼组：索拉非尼于5％DMSO中；对照组：与索拉非尼组相同的溶剂。每两天用天平或游标卡尺测量体重和肿瘤体积。使用公式1/2×[长度×2]计算肿瘤体积。治疗2周后，将动物斩首安乐死，并收集肿瘤组织进行进一步分析。所有数据均表示为平均值±标准偏差。使用SPSS17.0进行统计分析。进行了独立样本学生t检验和单样本学生t检验，以确定两组之间差异的显着性。的差异P<0.05被认为是统计学显著。
　　 为了表征索拉非尼介导的细胞信号通路并强调其在肿瘤细胞中的细胞抑制作用，关注泰瑞沙的药神网在暴露于该药物后对Huh7.5细胞进行了蛋白质组学分析。关注泰瑞沙的药神网在用索拉非尼处理24h或42h的Huh7.5细胞中分别鉴定了127和216种蛋白被下调。在索拉非尼治疗后，这些下调的蛋白质中有22种参与FA代谢，特别是脂肪生成。然后，关注泰瑞沙的药神网使用蛋白质印迹法进一步验证了蛋白质组学数据。如图所示。用索拉菲尼处理Huh7.5细胞6h后，检测到负责FA生物合成和去饱和的关键酶的表达水平发生了变化。生产丙二酰-CoA的由ACC1是在第一关键步骤从头FA生物合成，和ACC1可以在Ser79。在经索拉非尼处理的细胞中，ACC1蛋白水平保持相对不变，而ACC1磷酸化水平升高。FASN催化从acety1-CoA和丙二酸-CoA合成棕榈酸酯，在经索拉非尼处理的细胞中FASN蛋白水平降低。FADS2催化亚油酸的初始限速去饱和，以γ-亚麻酸和α亚麻酸，以十八碳四烯酸。索拉非尼治疗后FADS2的表达水平降低。在所有下调的蛋白质中，索拉非尼治疗的最大作用是对SCD1的影响，SCD1的主要作用是将硬脂酸酯转变为油酸酯，这是合成单不饱和FA的限速步骤。索拉非尼导致SCD1蛋白水平在24h和42h治疗中分别下降0.277倍和0.268倍。此外，索拉非尼还对HepG2和Bel-7402肝癌细胞中p-ACC，FASN，FADS2和SCD1的蛋白质表达水平产生了类似的影响。
　　 索拉非尼显着降低SCD1表达，使关注泰瑞沙的药神网考虑这种显着降低是否导致索拉非尼诱导的细胞死亡。为了回答这个问题，构建了scd1基因的过表达载体，并将其转染到Huh7.5细胞中。转染24小时后，将细胞接受不同剂量的索拉非尼48小时，然后通过MTT测定法测量细胞活力。结果表明，SCD1在转染的Huh7.5细胞中成功过表达，并且过表达SCD1明显防止了索拉非尼诱导的细胞死亡，提示SCD1在索拉非尼引起的细胞死亡中的功能重要性。此外，索拉非尼诱导的细胞死亡也可以通过在HepG2和Be1-7402肝癌细胞中过度表达SCD1来预防。
　　 鉴于索拉非尼极大地改变了参与脂肪形成和去饱和的酶的表达水平，关注泰瑞沙的药神网进行了基于质谱的脂质组学分析，以研究索拉非尼对Huh7.5细胞脂质代谢的影响。原始数据对潜在结构判别分析得分图的正交投影表明主要的分离是在用索拉菲尼处理0、24和42h的细胞之间，这表明3组之间的脂质分子存在显着差异。索拉非尼处理过的细胞大量消耗了二酰基甘油，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱，而暴露于该药物42小时后，甘油三酸酯的数量却大大增加了。DG是从头脂质生物合成途径中的中间体；因此，降低的DG水平表明脂质代谢减少。此外，索拉非尼治疗引起脂质TG类中酰基链组成的持续扰动。其示出单个TG物种的索拉非尼处理的细胞与对照细胞相比的相对倍数变化。在索拉非尼处理的细胞中，具有饱和和单不饱和链的TG种类的相对比例降低，而具有多不饱和链的TG的比例增加。这表明在存在索拉非尼的情况下，细胞可能减少了饱和和单不饱和FA的从头合成。
　　 然后关注泰瑞沙的药神网分析了在这些细胞中的所有游离脂肪酸，发现饱和的和单不饱和的FA的数量减少，增加用索拉非尼治疗，与上述图中提到的数据一致。Huh7.5细胞中单不饱和FFA的主要种类为C16：1和C18：1，暴露于索拉非尼时，这些含量的相对变化。索拉非尼治疗42h可使C16：1和C18：l的稳态浓度分别降低约15％和10％，表明通过添加索拉非尼可大大减少单不饱和FA的生成。重要的是，C16：1和C18：1的耗竭水平与SCD1表达的显着降低有关。鉴于SCD1主要催化饱和FAs分别脱氢成相应的单不饱和C16：1和C18：1，这些结果表明索拉非尼通过抑制SCD1表达来影响细胞内FFA池。SCD1的主要产物油酸盐是在Huh7.5细胞中发现的最丰富的FFA。索拉非尼引起的C18：1FFA水平耗尽和SCD1浓度降低使关注泰瑞沙的药神网考虑添加外源油酸盐是否可以使Huh7.5细胞从索拉非尼死亡中拯救出来。油酸酯，一个复杂的用BSA的添加，以剂量依赖的方式。补充300uM油酸盐后，这些细胞的细胞活力比未经油酸盐处理的细胞高1.4倍。然后，关注泰瑞沙的药神网用流式细胞术通过碘化丙啶排除法测量了用外源油酸盐处理过的索拉非尼治疗的细胞的细胞死亡。关注泰瑞沙的药神网观察到在存在外源油酸盐的情况下，索拉非尼诱导的细胞死亡明显减少。同样，油酸盐可提高索拉非尼治疗的HepG2和Bel-7402肝癌细胞的生存能力，并显示出剂量效应关系。据报道，索拉非尼诱导线粒体依赖的凋亡途径，涉及细胞色素c从线粒体释放到细胞质中。免疫荧光染色的结果表明，在索拉非尼治疗后确实观察到细胞色素c的释放，但有趣的是，当索拉非尼治疗与添加油酸盐组合使用时，该释放显着降低。此外，关注泰瑞沙的药神网通过蛋白质印迹法确定了在不存在或存在油酸盐的情况下，用索拉非尼处理的细胞线粒体中细胞色素c的相对量。与图中的数据是一致，除了油酸可以防止从线粒体细胞色素C的释放到胞质溶胶中由索拉非尼。这些数据表明索拉非尼通过涉及SCD1抑制和油酸盐耗竭的新型细胞死亡机制。通过使用SCD1基因敲除或抑制剂，进一步证实了这种新型细胞死亡途径的有效性，这也可以诱导细胞死亡，而可以通过添加外源油酸酯来预防细胞死亡。
　　 已经研究肝脏脂肪生成靶向的AMPK-mTOR信号-SREBP1通路的营养依赖性激活肝从头脂肪生成。关注泰瑞沙的药神网首先研究了索拉非尼对能量传感器AMPK磷酸化的影响，该能量被细胞ATP耗尽后被磷酸化并被激活。在Huh7.5细胞，并在细胞内ATP水平图的降低是一致的。然后，关注泰瑞沙的药神网评估了AMPK的下游相互作用伴侣mTORSer2481的磷酸化水平，发现索拉非尼降低了该位点的mTOR磷酸化水平。SREBP1是控制细胞脂质稳态的转录激活因子。SREBP1前体形式经过两步蛋白水解处理，导致成熟形式释放，后者进入细胞核，并与产物介导的许多基因的启动子区域中的固醇调节元件结合。胆固醇和脂肪酸的合成。在关注泰瑞沙的药神网的研究中，索拉非尼显着降低了成熟SREBP1的水平。同时，在关注泰瑞沙的药神网的研究中还检测了索拉非尼治疗的HepG2和Bel-7402肝癌细胞中的磷酸化AMPKα，磷酸化的mTOR和SREBP1的蛋白水平；与Huh7.5细胞一样，索拉非尼可以通过调节HepG2和Bel-7402细胞中的AMPK-mTOR-SREBP1途径来显着抑制SCD1表达。为了确认该途径在SCD1表达中的作用，关注泰瑞沙的药神网用索拉非尼和化合物C作为AMPK抑制剂处理了细胞。有趣的是，化合物C以剂量依赖性方式显着阻止了索拉非尼诱导的SCD1表达下降。因此，结果表明索拉非尼对SCD1表达的影响是由AMPK-mTOR-SREBP1途径介导的。
　　 每天将含有Huh7.5异种移植肿瘤的BALB/c-nu小鼠接受20mg/kg索拉非尼治疗2周，然后对其实施安乐死，并切除并分析其肿瘤组织。根据肿瘤体积确定，索拉非尼显着抑制了Huh7.5异种移植小鼠的肿瘤生长。所有小鼠维持正常体重整个治疗。在索拉非尼治疗的小鼠中检测到了负责FA生物合成和去饱和的关键酶的表达水平变化，包括增加的p-ACC1水平和降低的FASN，FADS2和SCD1水平。此外，通过蛋白质印迹检测到的肿瘤组织中，并且发现，该AMPK-mTOR信号-的SREBP1途径在用索拉非尼。这些数据表明索拉非尼通过调节AMPK-mTOR-SREBP1-SCD1信号通路抑制体内肝癌的生长。
　　 上述结果表明，油酸盐通过恢复细胞ATP水平来预防索拉非尼诱导的细胞死亡。因此，关注泰瑞沙的药神网想知道油酸盐是否可以抵消索拉非尼介导的SCD1表达抑制。表明通过添加油酸酯可强烈逆转索拉非尼介导的SCD1表达的下降，这表明索拉非尼诱导的ATP耗竭可能导致SCD1表达的抑制为继发作用。为了进一步解决这个假设，如上所述，关注泰瑞沙的药神网在索拉非尼治疗期间直接补充了ATP或腺苷。添加1mMATP或腺苷可有效逆转索拉非尼介导的SCD1表达抑制。此外，与不存在ATP或腺苷的情况下检测到的相应水平相比，外源ATP或腺苷的添加降低了索拉非尼治疗的细胞中AMPKα的磷酸化并增加了成熟SREBP1的表达。
　　 SREBP1c是脂肪生成基因，其中的一个关键转录因子FASN，SCD1，ACC1和潮流2，它起着调节的重要作用从头脂肪生成。在这项工作中，构建了srebp1c基因的超表达载体，并将其转染到Huh7.5细胞中。结果表明，SREBP1c在转染的Huh7.5细胞中成功地过表达，并且通过SREBP1c的过表达明显防止了索拉非尼诱导的细胞死亡。然后，关注泰瑞沙的药神网检测到scd1，fads2和fasn的转录和翻译水平带有或不带有SREBP1c过表达的索拉非尼治疗细胞中的基因。这些基因通过诱导索拉非尼的，降低的mRNA和蛋白水平通过SREBP1c的过表达显着恢复。此外，SREBP1c的过表达也可能促使ATP生产损失恢复到大约原始状态。这些结果进一步表明，SREBP1c可能对索拉非尼的作用具有抗性，包括细胞死亡，脂肪形成基因的mRNA和蛋白质水平降低以及ATP产量降低。
　　 据报道，索拉非尼通过直接靶向线粒体电子转运链复合物II/III和ATP合酶来诱导细胞凋亡。结合关注泰瑞沙的药神网的工作，关注泰瑞沙的药神网可以提出索拉非尼诱导细胞ATP水平消耗和细胞能量应激，激活AMPK-mTOR-SREBP1途径，并最终导致SCD1表达的抑制。此外，SCD1的主要细胞产物油酸盐的损失导致进一步的线粒体功能障碍，并最终导致细胞死亡。此外，单不饱和FA合成的减少进一步触发了索拉非尼处理的细胞中ATP产生的更严重减少。鉴于SCD1抑制在索拉非尼介导的癌细胞死亡中的关键作用，关注泰瑞沙的药神网研究了索拉非尼和A939572对Huh7.5细胞的联合作用。组合指数被广泛用作药物相互作用的指标，具有累加效应，协同作用和拮抗作用的定量定义。所计算出的结果确定了联合治疗是协同作用尤其是在较低的浓度，这表明SCD1抑制剂可以用作新型候选药物以增强索拉非尼的肝癌治疗效果。
　　 靶向疗法已经改变了晚期癌症治疗的局面，部分原因是与传统的细胞毒性药物相比，靶向疗法显示的毒性较小。癌症是一种由多种遗传和表观遗传因素定义的异质性疾病。靶向药物的功效在很大程度上受到肿瘤中特定分子改变的影响。索拉非尼是美国食品和药物管理局批准的唯一一种用于治疗晚期肝癌的药物。尽管它是一种靶向药物，但对它的不同的化学敏感性最终是由特定患者的肝癌细胞定义的。为了提高索拉非尼治疗肝癌的功效，需要确定强调其化学敏感性的新细胞信号通路。肝癌细胞表现出加速的脂肪生成，并强烈依赖它。因此，关注泰瑞沙的药神网以分子水平研究了索拉非尼在肝癌细胞中对该过程的影响。关注泰瑞沙的药神网对索拉非尼治疗对脂肪生成的影响的主要观察结果如下。其次，索拉非尼引起SCD1浓度的显着降低，而添加油酸盐则可保护肝癌细胞免受线粒体功能障碍和药物诱导的细胞死亡。第三，索拉非尼对Huh7.5细胞脂肪生成的抑制作用可能是由ATP-AMPK-mTOR-SREBP1途径介导的。
　　 许多癌细胞的新陈代谢标志是对从头FA生物合成的依赖以及由于相应酶的活性增加而引起的脂肪生成增强。靶向这些酶已显示出对癌细胞的选择性毒性，表明该途径可能代表了抗癌药物的良好靶标。即使存在外源性FA，癌细胞仍偏爱FA生物合成途径的原因仍不清楚。除脂肪细胞外，正常细胞不利用该途径，正常细胞从外源获得其FAs。特别是，癌细胞似乎对单不饱和FA高度依赖，因此连续产生需要通过去饱和酶转化为不饱和FA的饱和FA。SCD1是催化不饱和脂肪酸生物合成的关键脂肪生成酶，包括不饱和脂肪酸的主要成分，如TG，DG，磷脂，蜡酯和胆固醇酯等复杂脂质类。因此，SCD1被认为是维持细胞膜结构，产生脂质信号分子和储能物质的关键酶。鉴于肿瘤细胞比正常细胞更依赖于SCD1活性，SCD1是抗癌治疗的诱人潜在靶标。先前的研究已报道，SCD1抑制会导致内质网应激，线粒体异常和癌细胞凋亡。在这里，关注泰瑞沙的药神网表明索拉非尼通过降低SCD1表达的水平抑制了从饱和FA到单不饱和FA的转化，最终导致细胞死亡。因此，SCD1的过表达显着降低了索拉非尼对细胞的毒性，外源油酸酯的加入增强了细胞活力，并阻止了索拉非尼处理过的细胞中细胞色素c的释放。此外，RNAi对SCD1的抑制和抑制剂A939572对SCD1的抑制均导致Huh7.5细胞死亡，外源油酸酯可部分降低Huh7.5细胞的死亡。
　　 尽管索拉非尼被公认为是有效的多激酶抑制剂，但其对线粒体的作用也早已被人们认识。据报道，索拉非尼导致内线粒体膜电位和细胞凋亡的去极化由于线粒体的通过直接抑制两个电子传递链复合物II和III以及ATP合成酶活动的障碍。在这项研究中，关注泰瑞沙的药神网表明索拉非尼可诱导线粒体异常，包括断裂和超微结构改变，这些影响可通过添加油酸盐来预防。此外，索拉非尼治疗在Huh7.5细胞中可诱发线粒体功能障碍，例如细胞ATP含量降低，并且通过添加油酸盐也可减轻这种影响。这些结果表明，油酸盐的损失或SCD1水平降低会增加索拉非尼诱导的线粒体形态和功能异常。先前已证明SCD1抑制会迅速影响心磷脂FA侧链的组成，从而导致线粒体异常，线粒体通透性，细胞色素c释放和随后的细胞死亡。此外，之前报道了通过抑制细胞内膜脂质变化引起的自噬体-溶酶体融合，SCD1抑制引发线粒体崩溃和细胞死亡的途径。在这项研究中，索拉非尼诱导的SCD1抑制影响线粒体的机制尚不清楚。需要更多的努力来确定由SCD1抑制引起的细胞内膜脂质组成的改变是否影响线粒体膜的最佳流动性并引起随后的线粒体损伤。
　　 索拉非尼治疗引起线粒体损伤，导致细胞内ATP水平急剧下降，并引起能量应激。作为重要的生理能量传感器，AMPK是细胞能量稳态的主要调节剂，其协调多个代谢途径来平衡能量供应。已知活化的AMPK使mTOR的负调节剂的结节性硬化复合物2磷酸化并活化。因此，AMPK-mTOR途径可作为调节细胞代谢，能量稳态和细胞生长的信号纽带。肝脂肪形成的研究已针对肝脏新生脂肪形成中AMPK-mTOR-SREBP1途径的营养依赖性激活进行了靶向，并且有充分的证据表明AMPK激活通过mTOR抑制SREBP1。先前的研究报道索拉非尼可通过抑制线粒体代谢并增加细胞AMP：ADP和ADP：ATP比例间接激活AMPK。与这些发现一致，关注泰瑞沙的药神网发现AMPK-mTOR-SREBP1途径由于索拉非尼对线粒体的损害而被降低的ATP水平激活，从而导致SCD1表达降低。重要的是，外源油酸盐的加入挽救了SCD1表达的降低可能是因为添加油酸盐可以挽救线粒体功能并增加细胞ATP水平，从而部分阻止AMPK-mTOR-SREBP1途径的激活。SREBP1c的过表达对索拉非尼对Huh7.5细胞的影响具有明显的抵抗力，包括细胞死亡，脂生基因的mRNA和蛋白质水平降低以及ATP产量降低，进一步表明AMPK-索拉非尼治疗的Huh7.5细胞中的mTOR‐SREBP1‐SCD1途径。SREBP1c是调节肝脏从头脂质合成的关键转录因子，被认为是SCD1的上游。索拉非尼治疗后，SREBP1c的蛋白表达显着降低，而SREBP1c的过表达可挽救SCD1蛋白水平的下降，表明SCD1的表达可通过SREBP1c途径进行调节。另外，AMPK在SREBP1c的上游，并且可以直接磷酸化SREBP1c。索拉非尼引起的活化的AMPK促进SREBP1c的磷酸化并抑制SREBP1c的核易位，从而导致成熟SREBP1c水平降低和SCD1水平降低。
　　 索拉非尼和A939572的联合治疗在Huh7.5细胞中具有协同作用，表明SCD1抑制剂可以增强索拉非尼的抗癌活性。这些见解在开发新的合理设计的索拉非尼联合治疗肝癌的疗法中可能有用。总而言之，关注泰瑞沙的药神网表明，在Huh7.5细胞中，索拉非尼诱导线粒体损伤，ATP生成抑制，ATP-AMPK-mTOR-SREBP1途径活化，SCD1表达降低以及单不饱和FAs水平降低。这项工作与更广泛的肝癌治疗相关，因为索拉非尼和A939572之间具有明显的协同作用，因此正在做出更多努力来开发可通过干扰SCD1破坏FA生物合成的治疗剂。据关注泰瑞沙的药神网所知，这是索拉非尼破坏脂质生物合成及其对药物细胞毒性的贡献的第一份报告，据此关注泰瑞沙的药神网证明索拉非尼通过ATP‐AMPK‐mTOR‐SREBP1信号通路靶向SCD1触发癌细胞死亡。关注泰瑞沙的药神网的结果有助于提高索拉非尼在临床上的治疗效果，但未来对索拉非尼损害线粒体确切机制的研究仍需在关注泰瑞沙的药神网的实验室中进一步确定。