肝细胞癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一。近年来，外科手术切除，消融和肝移植等根本疗法改善了HCC患者的预后。但是，由于诊断轻度肝功能损害并不容易，因此大多数HCC患者被诊断为晚期，因此不适合进行根治性治疗。肝癌的总体预后仍然不容乐观。索拉非尼，一种多激酶抑制剂，被第一靶向药物批准用于晚期HCC治疗。尽管索拉非尼已被证明可以改善晚期肝癌患者的预后，但由于低应答率，耐药性导致有限的生存获益。因此，有必要弄清与索拉非尼耐药相关的潜在机制，并确定克服耐药的方法，以改善索拉非尼在肝癌中的抗肿瘤作用。在过去的几十年中已经确立了炎症诱发癌症的概念，并且研究发现炎症因子几乎影响了肿瘤发展的所有阶段以及治疗的有效性。炎性细胞因子如白介素-1a被认为是致瘤细胞因子，而IL-1a是晚期大肠癌的有希望的治疗靶点。IL-6的水平升高与差存活结果在许多癌症相关，并且最近的研究表明，IL-6抗体可以增强化疗或抗肿瘤作用吉非替尼在多种肿瘤细胞中。在许多不同的癌症中，促进细胞迁移和血管侵袭并诱导血管生成的转化生长因子-B明显升高。最近的研究还表明，TGF-B下调增强表皮生长因子受体靶向性治疗的抗肿瘤功效。综上所述，上述研究的结果表明炎症因子可能是潜在的抗肿瘤治疗靶标。
　　 肿瘤坏死因子-a是最重要的炎症细胞因子之一，它首先被鉴定为诱导肿瘤坏死的抗肿瘤细胞因子。最近的证据表明，TNF-a是炎症的主要介质，因此提供了慢性炎症与恶性肿瘤发展之间的分子联系。TNF-a主要由巨噬细胞产生，但它也是由多种肿瘤细胞的产生，包括胆囊和肾癌和促进肿瘤侵袭和转移。最近的研究还表明，TNF-a在肝细胞中高表达。透明细胞肾细胞癌与舒尼替尼耐药有关。研究还表明，HCC中的TNF-a表达明显高于正常肝组织中的表达。但是，关于HCC对索拉非尼的敏感性，TNF-a表达的作用尚不清楚。综上所述，这些促使关注泰瑞沙的药神网探索TNF-a在HCC进展中的确切作用，并进一步研究其作为抗HCC治疗靶标的潜在作用。这项研究检查了HCC患者中TNF-a表达与索拉非尼耐药的关系。结果表明高TNF-a表达与对索拉非尼的较差反应有关。关注泰瑞沙的药神网还证明索拉非尼对TNF-a表达没有明显影响。此外，关注泰瑞沙的药神网的研究结果还表明，用乌司他丁抑制TNF-a可增强索拉非尼在NF-kB/EMT信号通路中高表达TNF-a的HCC细胞中的作用。因此，关注泰瑞沙的药神网的研究表明，TNF-a的过度表达是索拉非尼耐药的新机制，而抑制TNF-a可能会提高索拉非尼在肝癌患者中的疗效。
　　 人HCC细胞系HepG2，SK-HEP-1和Huh-7购自中国科学院细胞库。Hep3B和PLC/PRF/5HCC细胞获自美国典型培养物保藏中心。所有细胞系均在补充有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，并在含有5％CO2的气氛下于37°C孵育。
　　 索拉非尼购自拜耳制药，而乌司他丁购自TechpoolBio-Pharma。Snail，波形蛋白，E-钙黏着蛋白，Bcl-2，Bax和NF-kB的一抗购自CellSignalingTechnology。抗TNF-a抗体从Novus公司购买的，和抗PCNA抗体购自Abcam公司购得。抗3-磷酸甘油醛脱氢酶和B-肌动蛋白的抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗来自CWBIO。人TNF-aELISA试剂盒购自Abcam。收集了2007年1月至2014年6月在中山大学中山纪念医院接受手术切除并随后接受索拉非尼辅助治疗的62例HCC患者的临床资料。从术后30天内开始，每天两次口服400毫克剂量的索拉非尼治疗患者。肝切除后符合条件接受索拉非尼辅助治疗的患者被定义为具有高复发风险的患者，包括宏观血管侵犯，病理上的微血管浸润或仅接受姑息性外科手术和局部区域疗法的患者。将组织标本固定在福尔马林中，并嵌入石蜡进行免疫组织化学研究。该研究得到中山纪念医院伦理委员会的批准。所有患者均应就所有治疗进行书面知情同意，并将其数据用于研究目的。
　　 用3步免疫过氧化物酶方法对肝癌组织的连续切片进行染色。将切片用二甲苯，乙醇和软化水脱蜡。然后通过在1mMEDTA中煮沸10至15分钟来回收抗原。将切片在软化水和磷酸盐缓冲盐水中洗涤后，添加一抗并将切片在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤后，将切片与EnVisionMouse或Rabbit缀合物在37℃温育60分钟。用DAB阳性底物完成显色反应。切片用苏木精复染。两名病理学家按照以下方式分别对染色结果进行评分。染色强度记为0，1，2或3。阳性肿瘤细胞的百分比分为五个等级：0，1，2，3和4。使用以下公式确定每个样品的总得分：总得分=强度得分×百分比得分。总分0–2、3–6、7–9和10–12分别定义为阴性，弱阳性，中度阳性和强阳性。
　　 从用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解的细胞中提取总蛋白。使用二辛可宁酸测定法测量细胞裂解物的蛋白质浓度，并在上样前进行平衡。通过SDS-PAGE分离出总共30g的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用适当的抗体进行免疫印迹分析，并使用增强型化学发光检测试剂盒可视化条带。如补充材料和方法中所述进行细胞活力，集落形成，ELISA，细胞凋亡分析和细胞侵袭测定。将HepG2和SK-HEP-1细胞接种到24孔板中，孵育24小时，然后用TNF-a或乌司他丁处理。接下来，洗涤HCC细胞并用4％多聚甲醛固定20分钟，并在0.3％TritonX-100中透化。与单克隆兔抗P65抗体在4°C下孵育过夜，然后与异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗在黑暗的湿箱中孵育60分钟。用PBS-T洗涤三次后，将细胞用DAPI复染5分钟。在倒置荧光显微镜下拍摄结果。
　　 4-6周大的BALB/c无胸腺雌性裸鼠购自中山大学实验动物中心。将小鼠保持在实验室中，用于特定的无病原体环境，层流气流条件，12小时的明暗循环以及22°C至25°C的温度下进行动物实验。所有动物均可免费获得标准实验室小鼠食物和水。动物实验得到中山大学生物伦理学委员会的批准，并按照既定的指导原则进行。将总共5×106SK-HEP-1细胞悬浮在200L无血清DMEM中，并注入小鼠的右腹。然后将小鼠随机分为三组：溶媒对照，索拉非尼和索拉非尼与UTI。一旦观察到可触知的肿瘤，就使用卡尺每三天测量一次肿瘤体积。使用以下公式计算肿瘤体积：V=×0.5，其中l和w表示每次测量收集的较大和较小尺寸。治疗2周后将小鼠处死，切下实体瘤，称重并固定在甲醛中。
　　 通过尾静脉将SK-HEP-1细胞注入4-6周龄的雌性裸鼠中，以模拟肿瘤转移。实验动物分为四组：媒介物对照，索拉非尼，UTI和索拉非尼与尿路感染联合使用。处理4周后处死小鼠，称重其肝脏和肺部并取样以进行组织切片。数据报告为均值±标准差，并使用Student'st检验和双向方差分析进行Bonferroni校正进行比较。p的值被认为指示统计学意义。
　　 为了测试TNF-a的表达并探讨其在HCC患者中的预后，关注泰瑞沙的药神网收集了62例接受手术治疗后接受索拉非尼辅助治疗的HCC患者的组织。在关注泰瑞沙的药神网的队列中，61.3％的TNF-a表达水平很高。统计分析表明，肝癌组织中TNF-a的高表达与多种临床病理特征呈正相关，包括TNM分期，BCLC分期和组织学分级。多元Cox回归分析提示TNF-a不是手术切除后总生存的独立危险因素，但结果表明TNF-a是手术切除后无复发生存的独立危险因素。此外，Kaplan-Meier分析表明，TNF-a的高表达与较差的总生存率和较高的复发率相关。两者合计，结果表明TNF-a的过表达与HCC的预后不良有关。关注泰瑞沙的药神网还通过Westernblot和ELISA检测了5种HCC细胞中TNF-a的表达水平。结果表明SK-HEP-1表现出较高的TNF-a表达，而HepG2细胞中的TNF-a表达要低得多。
　　 为了研究HCC细胞中TNF-a的生物学特性，关注泰瑞沙的药神网使用特异性shRNA敲低SK-HEP-1中的TNF-a表达，然后添加40ng/mLTNF-a刺激HepG2细胞。结果表明，TNF-a刺激可以促进HCC细胞的增殖和迁移能力，而SK-HEP-1细胞中TNF-a的下调显着降低了HCC细胞的增殖和迁移。此外，当关注泰瑞沙的药神网向SK-HEP-1-shTNF-a中添加外源性TNF-a时，其增殖和迁移能力得以恢复。为了确定TNF-a在介导HCC中索拉非尼耐药性中的作用，关注泰瑞沙的药神网用不同剂量的索拉非尼处理HCC细胞48小时。IC50HepG2细胞和SK-HEP-1细胞的值分别为6.20mol/L和12.83mol/L。然而，IC50与TNF-a预处理的HepG2细胞的值是8.12微摩尔/L，并且IC50为SK-HEP-1-shTNF-a细胞值7.32微摩尔/L。此外，增殖试验表明，索拉非尼以6mol/L的剂量能显着抑制HepG2细胞的生长，但当用TNF-a刺激预处理HepG2细胞时，抑制效率大大降低。然而，索拉非尼仅显示出对SK-HEP-1细胞生长的轻度抑制，而却明显抑制了SK-HEP-1-shTNF-a细胞的增殖能力。
　　 以前的研究已经暗示EMT和索拉非尼电阻之间的关联和宽范围的证据表明，TNF-a可以在不同的癌细胞诱导EMT。关注泰瑞沙的药神网的结果还表明，TNF-a诱导了HCC细胞EMT标志物的典型变化。关注泰瑞沙的药神网探索了索拉非尼对EMT的作用，关注泰瑞沙的药神网发现索拉非尼降低了蜗牛和波形蛋白的含量，并增加了E-钙黏着蛋白的含量。在HepG2细胞中但是，当将TNF-a预添加到HepG2细胞中时，索拉非尼逆转EMT的作用降低了。值得注意的是，关注泰瑞沙的药神网的结果表明，无论是否存在TNF-a，索拉非尼对SK-HEP-1细胞中的EMT几乎没有影响。此外，当用3、6和12mol/L浓度的索拉非尼处理HCC细胞时，关注泰瑞沙的药神网发现索拉非尼对两种HCC细胞系中的TNF-a表达几乎没有影响。
　　 乌司他丁被广泛用于治疗炎症相关疾病。先前的研究已经表明，乌司他丁抑制巨噬细胞和乳腺癌细胞产生TNF-a的。在当前的研究中，肝癌细胞以不同浓度的乌司他丁培养48小时。Western印迹结果显示以剂量依赖的方式。ELISA检测TNF-a的结果表明，乌拉司他汀800和1600U/mL可以显着降低HCC细胞上清液中的TNF-a水平，而索拉非尼在6和12mol/L的浓度下几乎不影响TNF-a的分泌。关注泰瑞沙的药神网进一步检查了乌司他丁对逆转HCC细胞EMT的作用。结果显示，当乌司他丁的浓度超过1600U/mL时，两种HCC细胞系中的上皮标记E-钙粘着蛋白均显着上调，而间充质标记则显着下调。此外，当关注泰瑞沙的药神网使用浓度为1600U/mL的乌司他丁来下调HepG2和SK-HEP-1细胞中的TNF-a时，蛋白质印迹结果表明索拉非尼在两种HCC细胞系中均显着抑制EMT。
　　 由于关注泰瑞沙的药神网发现乌司他丁下调TNF-a会促进索拉非尼抑制HCC细胞中的EMT，因此关注泰瑞沙的药神网推测乌司他丁下调TNF-a可能会改善索拉非尼对HCC细胞的作用，特别是对于高胆固醇血症的HCC细胞TNF-a的表达。在菌落形成试验中，单独的索拉非尼可将SK-HEP-1细胞的增殖抑制至对照的55.79％，而单独的乌司他丁仅可轻度抑制SK的增殖-HEP-1细胞。两种药物联合的效果优于任一种药物单独的效果。通过流式细胞仪测量的细胞凋亡率也发现了相似的结果和Westernblot检测PCNA，Bcl-2和Bax的表达，其中索拉非尼治疗单独使用优于乌司他丁，并且联合治疗优于单独使用两种药物。关注泰瑞沙的药神网证明索拉非尼和乌拉司他汀的组合比单独使用索拉非尼或乌拉司他汀可以更有效地抑制HCC细胞增殖并诱导细胞凋亡。伤口愈合试验的结果表明，与单独使用索拉非尼或乌司他丁的SK-HEP-1细胞相比，索拉非尼和乌司他丁的组合可显着抑制细胞迁移。此外，Transwell分析还显示索拉非尼和乌司他丁的组合可更明显地抑制细胞迁移和侵袭。此外，关注泰瑞沙的药神网还检测了联合疗法对HepG2细胞的作用，结果表明索拉非尼显着抑制了HepG2细胞的进程，而与索拉非尼和乌司他丁共同治疗具有更好的疗效。
　　 为了证实索拉非尼和乌司他丁在体内的协同作用，用SK-HEP-1细胞制备了异种移植肿瘤模型。与索拉非尼或对照组相比，与索拉非尼和乌司他丁联合治疗的组的肿瘤生长明显受到抑制。同时，在研究结束时，单独索拉非尼组的肿瘤重量为对照组的61.94％，而联合治疗组的肿瘤重量为对照组的32.35％。为了研究索拉非尼和乌司他丁联合治疗对体内转移的影响，通过以下方法将SK-HEP-1细胞注射入裸鼠体内：尾静脉模仿肿瘤转移。索拉非尼组的肺和肝转移分别减少到56.47％和54.07％。然而，当乌拉司他丁与索拉非尼联合治疗时，与对照组相比，肺和肝转移分别减少至16.40％和25.58％。
　　 关注泰瑞沙的药神网进一步探讨了乌司他丁对TNF-a抑制作用的信号传导机制。首先，关注泰瑞沙的药神网使用免疫荧光染色观察了P65核易位，发现外源性TNF-a明显诱导P65核易位，而乌司他丁则阻止了P65核易位。然后，关注泰瑞沙的药神网研究了索拉非尼和乌司他丁对NF-kB信号通路激活的影响。乌司他丁单独显着降低了磷酸化的IKK-B，IkB和P65，而索拉非尼对HCC细胞中NF-kB通路的抑制作用有限。此外，与这两种药物共同治疗比单独使用任何一种药物都有更好的效果。其次，为了确定抑制HCC细胞中NF-kB通路是否具有抗肿瘤作用，关注泰瑞沙的药神网用BAY11–7082处理了两种HCC细胞系，以抑制NF-kB的活性。蛋白质印迹结果表明，抑制NF-kB通路可显着逆转EMT并抑制HCC细胞的迁移。关注泰瑞沙的药神网还观察到，与索拉非尼和BAY11–7082共同治疗对HCC细胞的生长抑制作用比单独使用任何一种药物都要好。更重要的是在通过Transwell迁移测定法测量的细胞迁移和侵袭中也发现了相似的结果。对SK-HEP-1细胞模型中皮下肿瘤的肿瘤切片进行TNF-a，P65，波形蛋白和Ki67染色。结果表明，索拉非尼和乌司他丁共同治疗可显着抑制TNF-a，波形蛋白和Ki67的表达以及P65的核易位。有趣的是，结果表明索拉非尼单独对TNF-a和波形蛋白表达的作用有限，并且不能阻止P65的核易位。综上所述，这些结果表明乌司他丁可以抑制TNF-a/NF-kB信号通路，从而增强索拉非尼在肝癌中的抗肿瘤作用。
　　 在本研究中，关注泰瑞沙的药神网证明了TNF-a的表达与HCC患者对索拉非尼的治疗反应呈正相关。关注泰瑞沙的药神网首次发现索拉非尼不能降低TNF-a的表达和分泌。关注泰瑞沙的药神网还表明，乌司他丁，泌尿蛋白酶抑制剂广泛用于治疗炎性疾病，显着增强对抑制HCC的进展索拉非尼的效果的体外和体内。索拉非尼是目前唯一批准用于晚期肝癌患者的分子靶向药物。但是，由于耐药性，应答率不能令人满意。最近对两项3期研究的检查发现，炎症是索拉非尼治疗HCC患者后不良预后的指标。其他研究表明，高基线HBV负荷是不良生存率的独立预测因素，抗病毒治疗与索拉非尼合用可降低HCC患者的病毒负荷并改善总生存期。以上研究表明，抑制炎症反应可能是HCC患者的有效辅助治疗。
　　 炎症因素几乎影响肿瘤发展的所有阶段以及治疗的有效性。TNF-a是与癌症相关的炎症网络最重要的炎症介质之一。临床前研究中乳腺癌和胰腺癌表明，TNF-a促进肿瘤生长的体内和抗TNF-a处理可以抑制肿瘤的进展。先前的研究还表明，肝硬化患者的血清TNF-a水平和HCC比在健康个体显著更高，和TNF-a的高表达是积极与高等级肿瘤相关联，并且在HCC患者预测差的存活。关注泰瑞沙的药神网的结果表明，TNF-a与HCC细胞的增殖和侵袭能力呈正相关，这与先前对HCC和其他肿瘤的研究结果一致。然而，当前的研究是第一个证明TNF-a的表达与索拉非尼耐药在HCC细胞中呈正相关的研究。关注泰瑞沙的药神网系统地表明，索拉非尼可以显着抑制HepG2细胞中的EMT，但仅轻微影响TNF-a高表达的HCC细胞中的EMT。此外，当将外源性TNF-a添加到HepG2细胞中时，索拉非尼对EMT的抑制作用显着受损。重要的是，关注泰瑞沙的药神网发现索拉非尼不能降低TNF-a的表达和分泌。
　　 从最近的研究令人信服的证据已经凸显的概念，EMT是索拉非尼耐药的晚期肝癌的重要机制。索拉非尼对抑制EMT的影响已有报道，并且已经证明，索拉非尼对施加HGF介导的-EMT和具有有效的抑制效果TGF-B在HCC细胞介导-EMT。然而，尚未报道索拉非尼对具有不同TNF-a表达水平的HCC细胞逆转EMT的作用。关注泰瑞沙的药神网的结果表明，索拉非尼不会通过调节TNF-a的表达来抑制HCC细胞的EMT，但可能通过其他机制来抑制。在NF-kB信号通路已被证明在促进炎症反应中起重要作用，并起EMT的重要介体的作用。然而，索拉非尼对HCC细胞中NF-kB信号通路的作用仍存在争议。据报道，索拉非尼可有效抑制肝癌放疗所诱导的NF-kB信号通路的激活，从而增强放疗效果。然而，另一项研究表明持续的索拉非尼刺激可以激活NF-kB活性，从而诱导HCC细胞对索拉非尼产生耐药性。关注泰瑞沙的药神网的结果表明索拉非尼在抑制HCC细胞中NF-kB途径方面作用有限，已知TNF-a是NF-kB信号通路的激活剂，关注泰瑞沙的药神网的结果表明索拉非尼不会降低HCC细胞中TNF-a的表达和分泌。这可能是索拉非尼对HCC细胞中NF-kB/EMT信号通路影响有限的原因。
　　 关注泰瑞沙的药神网的研究还表明，TNF-a在HCC对索拉非尼的抗性中起重要作用。这促使关注泰瑞沙的药神网探索抑制TNF-a是否可以克服HCC细胞中的索拉非尼耐药性。先前的研究表明，来那度胺是一种可以抑制TNF-a表达的免疫调节药物，可以增强索拉非尼在HCC细胞中的抗肿瘤作用。但是，I期临床试验发现来那度胺和索拉非尼的组合由于毒性副作用而耐受性差。因此，探索一种低毒副作用的抗TNF-a药物可能有益于那些高表达TNF-a的HCC患者。在这里，关注泰瑞沙的药神网证明了在临床上广泛用于治疗炎症相关疾病的乌司他丁可以抑制HCC细胞中TNF-a的表达。最近的研究报告说，乌司他丁具有抗多种癌症类型的治疗作用，包括乳腺癌，恶性间皮瘤和结肠直肠癌，但现在它在肝癌的作用还不清楚。在当前的研究中，关注泰瑞沙的药神网发现乌司他丁联合索拉非尼在具有高表达TNF-a的HCC细胞中具有更显着的抗肿瘤作用，而在体外和体内。其机制可能是通过抑制TNF-a/NF-kB/EMT信号通路。其他研究表明，乌司他丁可以下调乳腺癌中TNF-a，IL-6和IL8的表达。在这项研究中，关注泰瑞沙的药神网主要集中于肝癌中TNF-a与索拉非尼敏感性的相关性，并证明乌司他丁可以抑制TNF-a的表达。因此，有必要探索其他炎性细胞因子，例如IL-6或IL-8也可能参与乌司他丁抗HCC的机制。综上所述，关注泰瑞沙的药神网的研究结果表明，靶向TNF-a可以克服HCC对索拉非尼的耐药性。关注泰瑞沙的药神网证明了乌司他丁可通过抑制TNF-a/NF-kB/EMT信号通路增强索拉非尼对HCC的抗肿瘤作用。进一步研究TNF-a抑制疗法对索拉非尼治疗HCC结果的影响是必要的。